【コラム】IC(イオンクロマトグラフィー)カラムのヒントとコツ
2020/03/30
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IC(イオンクロマトグラフィー)カラムの性能を監視・維持する
信頼性の高いクロマトグラフィー分析を確保するための基本的な要件の一つが、高性能な分離カラムです。イオンクロマトグラフィー(IC)のユーザーは、自らのカラムの性能を定期的にチェックすべきです。こうすることで、性能低下が明らかになった際に、十分な時間的余裕をもってカラムの適切な機能を回復または維持するための対策を講じることができ、サンプルスループットにおけるダウンタイムを削減できます。本ブログ記事では、カラム性能をどのように評価できるか、どのパラメータを監視すべきか、そして優れたカラム性能を確保するためにどのような対策を講じられるかについて説明します。
新しい分離カラムの初回使用時
カラムを初めて使用する際は、その初期性能を確認することを推奨します。Metrohm製カラムを購入する際に必ず付属する分析証明書(CoA)が、ここでの参照元となります。クロマトグラムを記録し、CoAに規定された分析条件を使用してください:これには流量、温度、溶離液(移動相)、分析種濃度、サンプルループサイズ、およびサプレッションが含まれます。
結果パラメータの一部を、CoAに記載された値(例:保持時間、理論段数、非対称性、分解能、およびピーク高さ)と比較することで、カラムの性能を評価することができます。
カラム性能の定期的な監視
既に使用中のカラムについても、定期的に監視すべきです!性能は分析の種類や関連する分析条件、そして装置構成によって異なるため、通常お使いの応用条件下で、チェック用標準物質を用いてこれらの試験を実施することを推奨します。性能低下が観測された場合、そのカラムをなお使用できるかどうかを判断するには、その応用の要件が重要になります。
以下では、5つの性能指標に基づいてカラム性能を判断する方法を説明します。また、性能低下を防止または是正する方法についてもご紹介します。
背圧
背圧を監視してください:新しいカラムを初めて使用する際は、お使いの応用の分析条件下での背圧値を参照値として(MagIC Netにおける「共通変数」として)保存してください。その後、ユーザー定義の結果を使用して、初期背圧と、現在の測定で表示される背圧との差を監視してください。
保存された初期値と比較して背圧の上昇が確認された場合、これはガードカラムまたは分離カラムのいずれかに粒子が堆積したことを示しています。測定された上昇幅が1 MPaを超える場合は、対策を講じる必要があります。まず、どちらのカラム(ガードカラムか分離カラムか)が影響を受けているかを確認すべきです。ガードカラムが汚染されている場合、それが本来の機能であるため、交換すべきです。分離カラムが影響を受けている場合は、システムから取り外し、向きを反転させて再設置し、この逆方向の流れで数時間すすいでください。これで改善しない場合、カラムの交換を強く推奨します。カラムの最大許容背圧に達している場合、この対応は必須となります。
保持時間
保持時間の変化(カラム性能の低下を示唆する)を追跡するため、クロマトグラム中の最後の分析種ピークの保持時間が監視されます。例えば硫酸塩は、通常標準的な陰イオンクロマトグラムの最後付近に溶出するため、これに適しています。ここでも、初期値を保存するためMagIC Netの共通変数を活用してください。
不安定な保持時間は、周囲の大気から取り込まれた二酸化炭素、または溶離液中に存在する気泡によって引き起こされる可能性があります。幸い、これらの問題は容易に解決することができます(表1参照)。
ご指摘ありがとうございます。修正します。
表1. ICカラムにおける性能低下の防止・是正。
| 指標 | 原因 | 予防・是正措置 |
|---|---|---|
| 背圧の上昇 | ガードカラム上の粒子 | ガードカラムを交換してください。 |
| 分離カラム上の粒子 | 分離カラムを逆方向の流れですすいでください:
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| サンプル中の粒子 | サンプル前処理(例:Inline Ultrafiltrationによる粒子の除去) | |
| 保持時間の短縮 | 溶離液中の炭酸塩 | 大気中の二酸化炭素は、溶離液中の炭酸塩/炭酸水素塩の平衡に影響を与えます。炭酸塩/炭酸水素塩溶離液は経時的に弱まり、水酸化物溶離液は強まります。
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| 溶離液中の気泡 | 気泡は溶離液の流れを不安定にします。背圧は流れの不安定性の指標です。±0.1 MPaの範囲内で安定しているべきです。
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| 高原子価イオンによるカラムの容量低下 | 無機性の堆積物を除去するため、カラムリーフレットに従ってカラムを再生してください。 | |
| 分解能の低下 | 溶離液が古い、または誤って調製された | 溶離液は新鮮に調製すべきです。正しく調製されていること、特に炭酸塩と炭酸水素塩が混同されていないことを確認してください。 |
| ガードカラムに堆積した汚染物質の吸着効果 | ガードカラムを交換してください。 | |
| 分離カラムに堆積した汚染物質の吸着効果 | 有機性・無機性の堆積物を除去するため、カラムリーフレットに従ってカラムを再生してください。 | |
| 理論段数の低下 | ガードカラムの汚染 | ガードカラムを交換してください。 |
| 分離カラムの汚染 | 有機性・無機性の堆積物を除去するため、カラムリーフレットに従ってカラムを再生してください。 | |
| 分離カラムの過負荷 | サンプルマトリックス中の高い塩分含有量などの要因により、分離カラムが過負荷になることがあります。
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| ICシステム内のデッドボリューム |
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| 非対称性 | ガードカラムのデッドボリュームまたは汚染 | ガードカラムを交換してください。 |
| 分離カラムの汚染 | 有機性・無機性の堆積物を除去するため、カラムリーフレットに従ってカラムを再生してください。 |
カラムはまた、容量の一部を失っている可能性もあります。この容量低下は、固定相への強い吸着性のため除去が困難な高原子価イオンの存在によって引き起こされることがあります。この場合、汚染物質を除去するため、カラムリーフレットに従ってカラムを再生すべきです。これで改善が見られない場合、特に容量低下が進行している場合には、用途の要件に応じてカラムの交換を検討してください。
容量低下は、官能基が固定相から永久的に脱離した場合にも起こり得ます。このような場合、カラムは再生できず、交換する必要があります。
分解能
所定のチェック用標準物質による測定値を初期参照値と比較することで、クロマトグラフィー分解能を監視してください。分解能がR > 1.5の場合、その信号はベースライン分離されているとみなされます(下記の図解を参照)。しかしながら、高濃度マトリックスを伴う場合や、より広く分布するピークについては、ベースライン分離を確保するために分解能値をより高くする必要があります。
分解能の低下が生じた場合、まずそれが溶離液やICシステムによって引き起こされたものではないことを確認してください。これらが除外された後、ガードカラムまたは分離カラム中の汚染物質による吸着効果が原因である可能性があります。汚染されたガードカラムは交換すべきです。問題の原因が分離カラムにあると判明した場合、有機性・無機性の汚染物質を取り除くため、カラムリーフレットに従ってカラムを再生すべきです。分解能の低下が進行する場合、カラムの交換は避けられません。
理論段数
先述の他のパラメータと同様、初期の理論段数をMagIC Netの共通変数として保存してください。通常、最後に溶出するピークが使用されます―陰イオンクロマトグラムでは、ここでも硫酸塩が適切な候補であることが証明されるでしょう。理論段数は分析種濃度にも依存します。したがって、このパラメータは、サンプル測定中ではなく、チェック用標準物質測定中に監視することが理想的です。理論段数への変化の推移は、MagIC Netのユーザー定義結果を通じて追跡することができます。
理論段数の減少は、ICシステム内のデッドボリュームを示唆する可能性があります(表1)。理論段数が少ない状態は、例えばサンプルマトリックス中の塩分濃度が高いことでカラムが過負荷になった場合にも観測されることがあります。理論段数が20%を超えて減少する場合、これはカラム性能が低下していることを示しています。用途の要件によっては、対策を講じる必要があるかもしれません。
性能低下の原因がガードカラムにある場合、交換すべきです。問題が分離カラムにある場合、有機性・無機性の汚染物質を除去するため、カラムリーフレットに従ってカラムを再生することを推奨します。これで改善しない場合、特に理論段数の低下傾向が観測される場合には、カラムの交換を検討すべきです。
非対称性
お使いの応用の分析条件下で所定のチェック用標準物質を測定することにより、分析種の初期非対称性を決定してください。これを共通変数として保存し、その後ユーザー定義結果を追跡することで、経時的な非対称性の推移を観測してください。非対称性の許容最大値は、分析種によって異なります。例えば、カルシウムやマグネシウムのピークは、初期段階で比較的高い非対称性値を示します。
非対称性は、ピーク高さの10%の位置において、ピークの中心線からピークの立ち下がり側までの距離(下図B)を、ピークの中心線からピークの立ち上がり側までの距離(下図A)で割った値として定義されます。一部の薬局方では異なる数値を使用している場合がありますので、お使いの国での要件をご確認ください。
AS>1はピークにテーリングがあることを意味し、AS<1はピークのフロンティングに相当します。最適なクロマトグラフィーは、ピークの非対称性が可能な限り1に近い場合に達成されます。一般的な原則として、非対称性がAS>2またはAS<0.5である場合、カラム性能は低下しているとみなされます。用途の要件によっては、この場合、対称性を改善し、より良い積分を可能にするための対策を講じる必要があります。
高い非対称性値の原因は、例えばデッドボリュームなど、イオンクロマトグラフ自体にある場合もあります。そうでない場合、その非対称性がガードカラムの問題によるものか、それとも分離カラムの問題によるものかを見極めることが重要です。ガードカラムが非対称性の原因である場合、交換すべきです。分離カラムが原因である場合、まず有機性・無機性の汚染物質を除去するため、カラムリーフレットに従ってカラムを再生すべきです。これで改善しない場合、カラムの交換を検討すべきです。非対称性値の上昇傾向が観測される場合、交換は避けられません。
まとめ
カラムの性能を推定し、その寿命全体にわたって具体的な数値を追跡する方法は数多くあります。適切なメンテナンス、そして常にガードカラムを使用して追加の保護を施すことは、分離カラムの寿命を延ばすことにつながります。詳しくは、このトピックに関する他のブログ記事もぜひご覧ください!
