このコラムは、イオンクロマトグラフィ用カラムの適切な使用に関するヒントとコツを提供するシリーズの3回目で最終回になります。第１回目は主に標準操作条件とカラムの操作制限について解説しました。 第２回目では、アプリケーション関連のトピックと、分離性能を変更するために変更できる溶出パラメーターに焦点を当てました。今回は、カラムのパフォーマンスを評価する方法を詳しく見て、発生する可能性のある問題の修正に役立つトラブルシューティングのヒントをいくつか解説します。

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• カラムパラメータ
• 保持時間とカラム容量
• 理論段数とピーク対称性
• カラム圧力
• カラムの寿命
• トラブルシューティングの対処方法について

重要なカラムパラメータ

まず、カラムの性能を判断するために使用できる主なパラメータを見てみましょう。これらの参照値のほとんどは、分析証明書から参照できます。分離カラム証明書は、  メトローム証明書ファインダー
メトローム証明書ファインダーから探すことができます。証明書のクロマトグラムを定期的に再現してカラムの性能を確認すると、性能の変化を検出し、カラムの不可逆的な損傷を回避するのに役立ちます。
 

メトローム証明書ファインダー

以下では、最も重要なパラメータを1つずつ検討します。

保持時間とカラム容量

個々の分析対象物のリテンションタイムは、カラムの選択性と容量の優れた指標です。分析対象物の保持時間が証明書の保持時間と一致しない場合、この動作には多くの理由が考えられます。

例えば、、溶離液成分が正しい濃度で存在せず、溶離液の組成が間違っている場合です。溶離液の強度が高すぎる場合、保持時間が短縮されます。この現象は通常、すべてのイオンで同時に発生し、すべてのピークを互いに近づけます。また、多価イオンは一価イオンよりも保持時間の変化が大きくなります。この問題は、正しい組成の新しい溶離液を準備することで改善できます。

溶離液中に周囲の大気からCO₂ が吸収する等して溶離液が新鮮でないか、十分に保護されていない可能性があります 。周囲空気からの二酸化炭素は、時間の経過とともに溶離液の組成（つまり、強度、pHなど）を変化させる可能性があり、これは分析対象物の保持時間に影響を与えます。炭酸イオンの溶出強度は水酸化物イオンの溶出強度よりもはるかに強く、保持時間の大幅な変化につながるため、弱い水酸化物溶離液はこの問題の影響を特に受けます。また、同様に多価イオンは一価イオンよりもこの影響を受けます。この問題は、新しい溶離液を準備し、CO₂吸着材を使用することで改善できます。。水酸化物溶離液を使用する場合、空気中からCO₂を吸収する可能性があるため、水酸化物原液の状態を確認することも重要です。 Fig.1 は一般的な陰イオンの保持時間に対する空気中からのCO₂取り込み時の影響を示しています。

一部のサンプルには、カラム材料のイオン交換基を占有する成分が含まれている場合があります。その場合、カラムで利用可能なイオン交換グループの数が初期状態に比べて減少し、カラム容量が明らかに小さくなり、リテンションタイムが短くなります。汚染物質の種類によっては、この影響を逆転させてカラム表面から洗い流せる可能性があります。これらの再生手順は、さまざまな固定相に個別に適合されており、カラムを保護するための最終手段として検討する必要があります。

手順と操作は、カラムのそれぞれのリーフレットに記載されており、メトロームのウェブサイト で確認することができます。ご検討される場合は、カラムの再生を実行する前に、Metrohmの販売店にご相談ください。

Metrosep ASupp17のリーフレット

• 汚染が多価イオンによるものである場合、通常、より高濃度の溶離液でカラムをフラッシュすることにより、それらを洗い流すことができます。その際、特に溶離液のpHに関して、カラムの性能限界注意してください。
• 有機分子は、カラムの固定相に強い親和性があり、吸着することがあります。これにより、イオン交換にまつわる作用が妨害され、保持時間が短縮や機器圧力が上昇する可能性があります。こういったことが発生した場合、有機溶媒を含む溶離液は固定相を洗浄するのに役立ちます。移動相への汚染物質の親和性が高まり、固定相から汚染物質を分離させ、洗浄します。

通常、このような再生手順の後、元のカラム容量を復元できます。

分離カラムの寿命を延ばす更に良い方法は、 ガードカラムを定期的に交換することです。その理由の1つは、ガードカラムで汚染物質を保持することによって分離カラムを汚染物質から保護することです。

ガードカラムは、分離カラムの寿命全体で3〜4回交換するか、染料や食品マトリックスなどの非常に複雑なサンプルマトリックスを扱う場合は、さらに頻繁に交換してください。このような状況では、 MetrosepRP2ガード/3.5。を使用することをお勧めします。

MetrosepRP2ガード/3.5

Fig.1のクロマトグラムオーバーレイ は、ピーク形状に対するガードカラムの欠陥の影響を示しています。

場合によっては、固定相への化学修飾によりカラム容量が減少します。これは、極端なpHの状況など、操作限界外の条件でカラムを使用した場合に発生します。極端なpH条件では、イオン交換基のベース粒子基板への化学結合が変化する可能性があります。この不可逆過程は、カラム容量の恒久的な損失につながります。こうなってしまうと、再生手順で元のカラム容量を復元することはできません。

このイオン交換基の喪失は、イオン交換カラムの通常の使用中にもゆっくりと発生することに注意してください。なお、イオン交換基の化学結合の強度は、Metrohmカラムの開発中に徹底的にテストされ、長いカラム寿命を提供しています。

理論段数とピーク対称性

理論段数（TP）は、カラムの充填状態を判断するための便利なツールになります。TP値が高いほど、カラムの充填が向上します。カラム充填層を有意義に判断するには、クロマトグラムの早い段階で溶出せず、二次相互作用の影響を受けない分析対象物を選択します（これらのピークは、特に2 mmシステムでは、カラム外の影響を受ける可能性があります）（例えば、硝酸塩の使用は避けてください）。陽イオンの場合はカリウム が、陰イオンの場合は 硫酸塩が適切な選択になります。

カラムは通常の操作圧力よりも高い圧力で充填されますが、充填層は、流動移動相（溶離液）を継続的に流すことで、カラムの寿命全体にわたってさらに高密度化を続けます。この効果により固定相の充填層は改良されますが、分離カラムの入口でデッドボリュームが発生する可能性もあります。このデッドボリュームは、特にクロマトグラムの開始時に、ピークの広がりと理論段数の減少の原因となる恐れがあります。

これはカラムの通常のエージングプロセスですが、カラムの手入れをすることで劣化を遅くすることができます。予防措置には、始動時の溶離液の流量と温度ゆっくりと上げていくことや、カラムを取り外す前の高圧ポンプの適切かつ完全停止が挙げられます。これは、機械的ストレスが充填層に悪影響を与える可能性があるためです。また、ガードカラムの交換は、理論段数とピーク形状に良い影響を与えることがよくあります（Fig.2を参照））。

カラム充填層の問題は、非対称係数値と全体的なピーク形状にも見られることがよくあります。より顕著なフロンティングとピークの広がりは、 カラムまたはガードカラムでのチャネリングの警告サインである可能性があります。残念ながら、この種のカラムの損傷は元に戻せず、分離カラムの交換が必要です。

カラムを交換する前に、クロマトグラムでピークの広がりが観察される場合は常に、問題がカラムまたはICシステムの別の接続に起因するかどうかを確認することが重要です。まずは、高圧経路のすべてのキャピラリの直径が0.25mm以下であり、すべてのキャピラリが追加のデッドボリュームなしで正しく取り付けられ、接続されていることを確認してください。内径が小さい（2 mm、マイクロボア）カラムを備えたシステムは、4mmカラムを備えたシステムよりもデッドボリュームの影響を強く受けます。これは、マイクロボアカラムを使用する場合、4 mmカラムを使用する場合と比較して、ピーク広がり効果が見えるようになるために必要なデッドボリュームが少ないからです。

カラム圧力

カラムの寿命を通して定期的にチェックするもう1つの重要なパラメータは、システム圧力です。高圧条件は、カラムの交換につながる最も頻繁な理由の1つです。圧力の上昇が見られる場合は常に、ICシステムのどの部分が原因であるかを確認することが重要です。

サンプルに粒子が含まれていて、サンプル前処理が不十分な場合、粒子はガードカラムの入口に蓄積し、最終的にシステム圧力の上昇につながります。この場合、ガードカラムは分離カラムを保護するという本来の用途を発揮してもらうため、交換する必要があります。ガードカラムをすぐに交換しないと、粒子汚染が進み分離カラムに負荷をかける可能性があります。粒子を充填したガードカラムの再生方法はありませんが、粒子で汚染された分離カラムは、逆流方向に低流量でカラムを洗浄することで再生できます。

これらの再生方法が常に成功するとは限らないことに注意してください。

ICシステムの高圧経路に粒子が注入されないようにすることは、ガードカラムと分離カラムを保護するための優れた方法です。メトロームカラムの寿命に伸ばすことにつながる いくつかの自動サンプル準備技術
を提供しています。この目的最も一般的な手法は、インライン限外ろ過（Fig. 3）およびインライン透析です。

メトロームインライン限外ろ過の詳細については、関連するブログ投稿をご覧ください。

インラインウルトラフィルタレーションの濾過膜を交換するタイミングはいつですか？

カラムの寿命

カラム（およびICシステム）の性能を判断するには、上記のすべてのパラメータを考慮する必要があります。これらのパラメータの多くは、
 MagICNetソフトウェア で綿密に監視できるため、潜在的な問題を可能な限り早く検出できます。

Metrohm ICカラムは非常に長い寿命を持つように設計および製造されていますが、ある時点でパフォーマンスが低下し、再生手順を実施しても、アプリケーションのニーズを解決するために必要なカラムパフォーマンスを復元できない場合があります。この場合はカラムの寿命を意味し、分離カラムの交換は避けられません。

メトローム分離カラムはリサイクルできないので、 通常の廃棄物と一緒に処分します。ただし、測定されたサンプル、使用された化学物質の種類、およびそれらに関連する危険性によっては、適切な廃棄オプションを検討する必要があることがあります。

サンプルの性質に関係なく、 どんな場合でもカラムを開けないでください。

トラブルシューティングの概要

表1 カラムのパフォーマンス動作を確認する際の特定のトラブルシューティング戦略の概要を示します。

結論

このコラムでは、ICカラムの性能をカラムの寿命全体にわたって評価および監視する方法と、カラムの寿命を長くするためにどのような対策を講じることができるかについて説明しました。これで、シリーズ「イオンクロマトグラフィーの分離カラムのベストプラクティス」を締めくくります。ご不明な点がございましたら、お近くのメトロームIC営業担当者までお気軽にお問い合わせください。

さらにイオンクロマトグラフィのカラムについて詳しく知りたい方へ

ICカラムのヒントとコツ