Best practice for separation columns in ion chromatography (IC) – Part 2
2021/10/18
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IC分離カラムのベストプラクティスに関する本ブログシリーズの第2部では、カラムの適合性と安定性に影響を与える、用途に関連するトピックに焦点を当てます。まず、意図する用途に最も適したカラムの適切な選び方について取り上げます。その後、分析種間の分離を最適化するために調整可能な操作パラメータ、そしてそれぞれの影響や可能性についてご紹介します。
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カラム長・カラム径の選択
メトロームは、異なる固定相を持ち、異なるカラム長および/またはカラム径を持つ、幅広いICカラムのラインアップを提供しています。固定相の選択は、一方では個々の分析種間の選択性に、他方では異なるサンプルマトリックスに対する安定性に、大きな影響を与えます。これに対し、カラム長は選択性には影響を与えず、むしろ個々のピーク間の分離効率に影響を与えます。
イオンクロマトグラフィー用の幅広い分離カラムラインアップについて詳しくは、カラムカタログをご覧ください。
カラム長の影響
以下のクロマトグラム(図1)には、Metrosep A Supp 17カラムシリーズにおける、カラム長が分離効率に与える影響が示されています。カラム長を選択する際は、意図する分離の複雑さ、そして対象イオンを妨害する可能性のあるマトリックス成分の有無を考慮すべきです。
カラム径の影響
異なるカラム長のICカラムを提供することに加え、メトロームはほとんどのカラムを内径4 mmおよび内径2 mm(「マイクロボア」として知られる)の両方のバージョンで提供しています。この点に関して、区別すべきいくつかの基準があります:
- 連続モードでオンラインシステムを使用する場合(すなわち、Metrohm Process AnalyticsのMARGAシステム―大気中エアロゾル・ガスモニター―のように、数日間連続して無人で稼働するシステム)、2 mm ICカラムの使用を推奨します。マイクロボアカラムでは流量が低減される(4 mmカラムの流量のわずか25%)ため、溶離液や再生液がはるかに長持ちし、装置を無人にしておける時間が延びます。
- より高い分析種選択性・感度のため、IC-MSのような複合技術を必要とする用途もあります。この場合、2 mmカラムの使用が理想的です。低流量はエレクトロスプレープロセスに最適であり、したがって質量分析計に入る前にフロースプリッターを必要としません。
- 場合によっては、注入用に限られた量のサンプルしか入手できないこともあります。このような状況では、2 mmカラムが好まれます。これは、分離プロセス中の希釈/拡散が少なく、したがってより高い信号が得られるためです。
- 一方、サンプルに多量のマトリックス成分が含まれている場合には、対象分析種をマトリックスから分離するためのより高い容量が得られるため、適切な4 mm ICカラムを選択する方が良い選択となります。
MARGAとその連続大気質モニタリング能力について詳しくは、ブログ記事をご覧ください。
分析種分離の最適化
カラム自体に加え、分離の選択性を最適化するために調整可能な、他のいくつかのパラメータがあります。これらのパラメータには、温度、溶離液成分と強度、そして有機修飾剤が含まれます。
温度調整の影響
ICにおいて分離選択性を微調整する最も簡単な方法の一つが、分析温度を調整することです。これは、装置に内蔵されたカラムオーブン(利用可能な場合)を使用することで達成されます。例えば陰イオン分析において、複数の効果が観察されます。一例として、Metrosep A Supp 17カラムラインにおける選択性に対する温度の影響を、クロマトグラム重ね合わせ図(図2)に示します。
- フッ化物、塩化物、亜硝酸塩、臭化物、硝酸塩のような一価イオンは、いずれも温度上昇とともに加速され、固定相との相互作用がより少なくなっていることを示しています。
- リン酸塩や硫酸塩のような多価イオンの挙動は、記述がより複雑であり、各固定相によって異なります。一般的に、多価イオンは高温になるほどより保持される傾向があり、これにより保持時間が延びます。これは硫酸塩において確認できます。一方、リン酸塩はこれとは異なる挙動を示します。これは、リン酸塩のpKa値に近い範囲において、温度により溶離液のpHが変化するためです。このpH変化により、リン酸イオンの実効電荷も変化します(この例では、温度上昇に伴い実効電荷が低下します)。
- 亜硝酸塩、臭化物、そして特に硝酸塩のような分極しやすいイオンのピーク形状は、高温になるほど大幅に改善されます。この挙動の理由は、固定相との二次的相互作用が低減されるためです。
溶離液組成・強度調整の影響
溶離液の組成と強度は、同じ分離カラムを使用しながら、複数の分析種の溶出順序を変えるために使用することができます。陽イオンクロマトグラフィーでは、P.R. HaddadとP.E. Jacksonによる保持モデルが開発されており、これにより研究者は溶離液組成を変更した際の保持時間を予測することができます[1]。
カラムが各測定において同一であることを考慮すると、イオン交換平衡やカラム容量の変化は生じないと考えられます。したがって、溶離液濃度のみを変更する場合、以下の相関を用いることができます:
ここで:
- k'は対象分析種の保持係数
- cは定数
- xは分析種の電荷
- yは溶離液の電荷
- Ey+Mは移動相中の溶離液の濃度
硝酸を溶離液として使用する場合、y=1となり、モデルは以下のように簡略化することができます:
この式を実験室での実際の状況に適用すると、以下のことを意味します:溶離液強度を上昇させると、アルカリ土類金属(x=2)はアルカリ金属(x=1)よりもはるかに速く加速され、したがってマグネシウムをカリウムより先に溶出させることが可能になります。この効果は電荷選択性と呼ばれます。
多価金属イオンは、専用の錯化剤と錯体を形成することができます。したがって、選択性は溶離液に錯化剤を添加することで調整することができます。一例として、ジピコリン酸(DPA)はしばしばカルシウムを錯化するために使用され、これによりカルシウムの実効電荷が低下します。その結果、カルシウムの保持時間は短縮され、クロマトグラム上でカルシウムがマグネシウムより先に溶出します(図3)。
一価陽イオンの保持は、移動相へのクラウンエーテルの添加によって影響を受けることがあります。
陰イオン系は保持時間モデルに関してより複雑ですが、電荷選択性の効果はある程度陰イオンにおいても同様に観察されます。しかしながら、溶離液強度を変更すると、溶離液pHもしばしば変化し、これにより多価陰イオン(例:リン酸塩)の脱プロトン化平衡が異なる結果となります。これは分析種の実効電荷に影響を与え、それによって、先述の温度変化の影響と同様の形で、その保持にも影響を与えます。
場合によっては、溶離液中にメタノール、アセトニトリル、あるいはアセトンなどの有機修飾剤を少量使用することが理にかなうことがあります:
- 以前に細菌汚染が問題となったことがある場合、溶離液に5%のメタノールを添加することで、今後の細菌増殖を防ぐのに役立ちます。
- 多量の有機溶媒を含むサンプルを注入する必要があり、抽出やマトリックス除去(MiPCT-ME)などのサンプル前処理が不可能な場合、有機溶媒がクロマトグラフィーカラムから適切に洗い流されるようにするため、溶離液に適切な有機修飾剤を添加することが推奨されます。
Metrohm Inline Sample Preparation(MISP)
- IC-MSを使用する場合、エレクトロスプレープロセスを改善するため、溶離液に有機修飾剤を添加することも推奨されます。
有機修飾剤の添加は分離選択性にも影響を与えることにご注意ください。標準的な陰イオンについては、この影響は温度上昇時に観察されるものと類似しています:亜硝酸塩、臭化物、硝酸塩のような分極しやすいイオンのピーク形状が改善されます。
一方、有機酸は標準的な陰イオンとは大きく異なる反応を示すことがあり、その反応は使用される有機修飾剤の種類にも大きく依存します。分析種の保持に対する有機修飾剤の影響を示すサンプルクロマトグラムは、Metrosep A Supp 10カラムのマニュアルに記載されています。
分析種の保持時間に対する有機修飾剤の影響を示すクロマトグラム例をご覧になるには、以下よりMetrosep A Supp 10カラムマニュアルをご覧ください。
参考資料
[1] Haddad, P. R.; Jackson, P. E. Ion Chromatography: Principles and Applications; Journal of chromatography library; Elsevier; Distributors for the U.S. and Canada, Elsevier Science Pub. Co: Amsterdam, Netherlands; New York: New York, NY, USA, 1990.
