【コラム】より正確で再現性の高いNIRS結果を得るために温度を管理する理由
2024/10/07
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このコラムでは、近赤外（NIR）吸収分光法における温度の影響と、なぜ温度管理が重要なのか、特に液体サンプルを分析する場合について考察します。これらの知見は、NIRS測定の正確性と再現性をどのように向上させることができるかを理解するうえで役立ちます。
近赤外分光法の基礎紹介
近赤外分光法は、光と物質の相互作用に基づく分析手法です。NIR分光計は、780～2500 nmの波長範囲におけるNIR領域の光吸収をサンプルから測定します。液体および固体の両方について、化学的パラメータだけでなく、物理的およびレオロジー的パラメータも検出することができます。結果は迅速（1分未満）に得られ、サンプル前処理や試薬は不要です。NIRSは二次分析法であるため、予測モデルを作成するには滴定などの一次分析法を使用する必要があります。
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振動遷移と温度依存性を結び付ける理論
分子の振動挙動を説明する最も基本的なモデルは、調和振動子モデルです（図1）[1,2]。
この理論は量子力学の枠組みの中で発展したものであり、分子または官能基の振動エネルギーを次の式を用いて説明します。
E = Energy
n = quantum level
h = Planck constant
ν = frequency
図1に示され、上記の式によって説明されるように、調和振動子モデルでは、特定の離散的なエネルギー準位（量子状態 n）のみが許容されるとされています。したがって、異なる振動状態間（例：n = 0 から n = 1）への遷移は、特定量のエネルギー（∆E）が与えられた場合にのみ起こります。
∆E = hν
エネルギー差∆Eはプランク定数 h と振動数 ν に依存し、ν は分子または官能基内の原子間の結合強度によって影響を受けます。計算されるエネルギー差は赤外（IR）光および近赤外光の範囲にあるため、IR光およびNIR光は振動遷移を引き起こすことができます。さらに、このモデルは、得られる吸収帯が異なる官能基に関連付けられる理由も説明しています。
温度は調和振動子の式には明示的には含まれていませんが、温度は分子がどのエネルギー状態に存在するかを決定するため、重要な役割を果たします。分子が特定のエネルギー準位に存在する確率は、ボルツマン分布によって記述されます [3]。
Pn = 量子準位 n の占有確率
En = エネルギー
kb = ボルツマン定数
T = 温度
Z = 分配関数
非常に低い温度では、分子は主として最も低いエネルギー状態（n = 0）を占有します。温度が上昇すると、より高い状態（n = 1、2、3、...）を占有する確率が増加します。
温度は分子の運動にも影響を与え、それによってスペクトルバンドの幅にも影響を及ぼします。温度が高くなると、ドップラー効果および分子の運動性向上による分子衝突の増加によって、ピークの広がりが生じます。これらの要因の影響は、液体よりも気体で顕著であり、固体では最も小さくなります［4］。
温度変化がNIR予測値に与える影響
温度がNIR結果に与える影響を調査するために、さまざまな液体アプリケーションを選択し、特定の温度における予測結果の変化をモニタリングしました。分析は26～38 °Cの温度範囲で実施しました。
各温度においてサンプルを3回測定し、NIR予測値の再現性誤差を評価しました。すべての測定はOMNIS NIR Analyzer LiquidおよびOMNIS Softwareを使用して実施しました。サンプル容器には、光路長8 mm、総充填容量1 mLの標準ガラスバイアルを使用しました。温度制御は、OMNIS NIR Analyzerに内蔵された機能を用いて行いました。代表的な測定シリーズを表1に示します。
表1. ポリオールサンプルの測定シリーズ。サンプルはまずOMNIS NIR Analyzerを用いて25 °Cまで冷却し、その温度で300秒間保持しました。その後、目標温度（例：26 °C）まで加熱し、測定を開始しました。この手順をさらに2回繰り返し、各目標温度について3回の測定を実施しました。
定性的には、同一温度で実施した測定の高い再現性は、スペクトルが非常に良好に重なり合っていることから明らかです（図2a）。これは、図2bに示される再現性の定量的評価によってさらに裏付けられています。この評価では、繰り返し測定から算出された再現性誤差が低いこと（絶対誤差 = 0.05 mg KOH/g、相対誤差 = 0.20%）が示されています。
異なる温度で測定したNIRスペクトルを比較すると、スペクトル形状の違いを直接観察することができます（図3a）。この変化はNIR予測結果にも影響を及ぼし、図3bに示されるように、サンプル温度が高くなるにつれて予測値が低下する明確な傾向が見られます。
他のアプリケーションについても調査した結果、温度が予測結果に影響を与えるという観察結果が確認されました。図4は、ポリオールのヒドロキシル価、メトキシプロパノール中の水分含有量、ならびにディーゼルのセタン指数および粘度の予測値に対する温度の影響を示しています。すべてのアプリケーションを比較すると、予測結果は温度変化に対して線形に変化することがわかります。各パラメータにおいて、温度が1度変化するごとの予測結果の絶対変化量が一定であることは、サンプル温度の変化に伴ってスペクトル形状が一貫して変化していることを示しています。
したがって、測定時にサンプル温度の管理を怠ると、NIR予測値の正確性と再現性の両方に影響を及ぼします。表2には、温度が1度変化するごとに生じる変化量を示しています。温度1度あたりの絶対変化量があるため、誘発される相対誤差は低濃度サンプルほど大きくなります。
表2. 各種アプリケーションにおけるサンプル温度が1度変化した際の、NIR予測値の絶対変化量および相対変化量の概要。温度変化によって生じる相対誤差は、対象パラメータの濃度が低い場合に非常に大きくなる可能性があります。
表3. ヒドロキシル価を測定パラメータとしたポリオールの例における総誤差の概要。総誤差には、再現性誤差に加え、温度偏差が1 °Cまたは2 °C生じた場合の温度起因誤差が含まれています。示されているように、温度が2度ずれるだけで、すでに1%を超える大きな誤差が生じます。
表3. 26 °Cにおいて予測値24.91 mg KOH/gを示したポリオールサンプルについての総誤差（再現性誤差および温度変動誤差）の概要。
NIR結果の正確性と再現性を向上させる方法
これらの知見に基づき、サンプルをそれぞれの目標温度まで加熱および／または冷却するための信頼性の高い方法を使用することを強く推奨します。NIRアプリケーションの一般的な実施ガイドラインを提供するASTM D6122でも、この必要性が強調されています。
A1.5 サンプル温度
サンプル温度は、密度変化および分子間相互作用のためにスペクトル測定の再現性に大きな影響を与え、その結果として予測値にも影響を及ぼす可能性があります。
NIRアナライザーを使用する際の一般的な解決策の一つは、サンプルホルダーを目標温度まで加熱し、サンプル投入後に一定の待機時間を設けて熱平衡状態に到達させることです。このアプローチにおける課題は、NIR分析の迅速性を活かしながら、サンプルが目標温度に到達することを保証する最適な待機時間を決定することです。特に、サンプルの初期温度は季節変動（例：冬期／夏期）による試験室内環境の違いの影響を受ける可能性があるため、この課題はさらに複雑になります。多くの場合、30～60秒の待機時間が用いられますが、実験結果から、そのような短い時間では不十分であることが示されています（図5）。
したがって、より高度なアプローチとして、サンプル温度そのものをモニタリングする方法があります。これらの実験で使用したOMNIS NIR Analyzerでは、複数の温度センサーと高度なアルゴリズムを組み合わせることにより、このような手法が可能になっています。OMNIS NIR Analyzerでは、測定開始前にサンプル温度を自動的に評価および制御する温度管理測定を設定できます。これには次のような複数の利点があります。
- 任意の待機時間が不要となり、高い分析速度を維持しながら目標温度への到達を確実にできます。
- 試験室環境の季節的な温度変化による測定時の温度変動を最小限に抑えることができます。
まとめ
温度変動がNIR測定に及ぼす影響と、その正確性および再現性への影響は、必ずしもすぐに明らかになるとは限りません。これは、温度変動が通常は長期間にわたって発生するため（例：試験室における季節的な温度変化）、アプリケーション開発やNIR予測モデルまたはライブラリの作成の初期段階では気付きにくいためです。
しかし、本測定シリーズで示したように、このような温度変動は、サンプル温度が1度変化するごとにNIR予測値の正確性および再現性へ1%以上の影響を及ぼす可能性があり、そのため制御する必要があります。理想的には、サンプルホルダーの温度だけでなく、サンプル温度そのものをモニタリングできる機能を用いて管理することが望まれます。
参考資料
[1] Heisenberg, W. Über quantentheoretische Umdeutung kinematischer und mechanischer Beziehungen. Z. Für Phys. 1925, 33 (1), 879–893. DOI:10.1007/BF01328377
[2] Landsberg, Gr. Molekulare Lichtzerstreuung in festen Körpern. I: Lichtzerstreuung im kristallinischen Quarz und ihre Temperaturabhängigkeit. Z. Für Phys. 1927, 43 (9–10), 773–778. DOI:10.1007/BF01397337
[3] Boltzmann, L. Weitere Studien Über Das Wärmegleichgewicht Unter Gasmolekülen. Sitzungsberichte Akad. Wiss. Zu Wien 76, 373–435.
[4] Herzberg, G.; Herzberg, G. Infrared and Raman Spectra of Polyatomic Molecules, 22. print.; Molecular spectra and molecular structure / by Gerhard Herzberg; van Nostrand: New York, 1987.
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