IC-PAD ile prebiyotiklerin analizi: AOAC 2001.02'nin iyileştirilmesi

Beslenme insan sağlığı için kritik öneme sahiptir. Geçtiğimiz birkaç yılda, gıda katkı maddelerine ve diyet takviyelerine, örneğin β-galaktooligosakkaritler (GOS'lar) gibi prebiyotiklere olan ilgi artmıştır. Gıda ve takviyelerdeki toplam GOS içeriğinin belirlenmesi, sıkı gıda etiketleme ve güvenlik gerekliliklerinin yerine getirilmesi açısından önemlidir. Toplam GOS tayini için en yaygın kullanılan yöntem, karmaşık molekülleri kromatografik analizden önce basit karbonhidratlara parçalamak için enzimatik hidrolize dayanmaktadır. Bu makalede, enzimatik hidrolizden sonra amperometrik tespit ile iyon kromatografi (IC-PAD) ve tam numune otomasyonu kullanılarak AOAC Metot 2001.02'ye yönelik bir iyileştirmenin avantajları özetlenmektedir.

GOS'lar nedir?

GOS'lar, isteğe bağlı bir glikoz ucuna sahip galaktoz birimlerinin zincirleridir. Bunlar genellikle çeşitli yiyecek ve içeceklerde az miktarda doğal olarak bulunurlar.

Başlarda anne sütünün ana bileşenleri olarak keşfedilen (12 g/L'ye kadar mevcut olan) GOS'lar, bebek mamalarına prebiyotik takviyesi olarak eklenmektedir. Bifidojenik etki gösterirler, yani patojenik olmayan bağırsak bakterilerinin büyümesini ve refahını desteklerler.

GOS takviyeleri, ham olarak ya da konsantre tozlar veya şuruplar halinde bulunmaktadır ve sonrasında, gıda üreticileri tarafından tüketici ürünlerini zenginleştirmek için kullanılmakta veya takviye olarak satılmaktadır.

GOS etiketleme gereklilikleri

Küresel prebiyotik ve GOS pazarlarında devam eden büyüme, sağlıklı beslenme konusunda artan tüketici bilincinin bir sonucudur. Benzer şekilde, gıda kalitesine ilişkin artan talep, gıda etiketleme ve güvenliğine (ör. EU 1169/2011 ve EU 2015/2283) ilişkin daha katı ve daha kapsamlı kuralların uygulanmasına yol açmıştır. Bu nedenle, gıda, takviye veya ham ürünlerdeki toplam GOS içeriğinin belirlenmesi, bu tür gerekliliklerin yerine getirilmesi için çok önemlidir.

GOS'un sağlığa etkileri üzerine yapılan çalışmalarda günde 30 g'ın altında maksimum dozlar önerilmektedir, ancak bu bebek mamaları için çok daha katıdır. Bunun dışında gıdalarda veya besin takviyesi niteliğindeki GOS içeriğine ilişkin başka bir sınırlama bulunmamaktadır.

Şekil 1. AOAC 2001.02'ye göre puls amperometrik tespit tekniği ile iyon kromatografi (IC-PAD) kullanılarak toplam GOS içeriğinin belirlenmesini ve Metrohm tarafından optimize edilen metodu (yeşil) içeren şematik gösterim. AOAC'de, anyonlar için kromatografi HPAEC (yüksek performanslı anyon değişim kromatografisi) olarak adlandırılır, ancak makalede bu IC genel terimiyle sadeleştirilmektedir.

AOAC 2001.02

Gıda ürünlerindeki toplam GOS'ları ölçmek için en yaygın olarak kullanılan yöntem AOAC 2001.02 standart yöntemidir. Bu yöntem, GOS'un bir numuneden ekstraksiyonuna, ardından oligosakkaritlerin monosakkaritlere enzimatik hidrolizine ve daha sonra bunların puls amperometrik tespiti ile yüksek performanslı anyon değişim kromatografisi ile analiz edilmesine dayanmaktadır.

AOAC'de, anyonlar için kromatografi HPAEC (yüksek performanslı anyon değişim kromatografisi) olarak adlandırılır, ancak makalede bu IC genel terimiyle sadeleştirilmektedir.

AOAC 2001.02'nin püf noktası, bir kontrol çözeltisinin bir enzim (β-galaktosidaz) ile işlenmiş ve hidrolize edilmiş bir çözeltiyle karşılaştırılmasıdır. Enzim glikozidik bağların bölünmesini katalize eder ve GOS'ları ve laktozu glikoz ve galaktoza hidrolize eder. Bu iki çözeltide belirlenen serbest galaktoz ve laktoz konsantrasyon farkları toplam GOS'ları hesaplamak için kullanılır (Şekil 1).

Şekil 2. Bimuno'nun (prebiyotik takviyesi) işlenmemiş (siyah) ve enzimle işlenmiş (turuncu) üst üste çakıştırılmış kromatogramları.

AOAC Metodunda Yapılan İyileştirmeler

AOAC 2001.02 için numune hazırlama oldukça karmaşıktır: yöntemin bir eksikliği, saf ekstrakt kullanmak yerine başlangıç karbonhidrat konsantrasyonlarını (Şekil 1) belirlemek için referans çözeltinin deaktive edilmiş enzimle (oldukça pahalıdır) inkübasyonudur. Bir diğer kritik nokta ise standartlar ultra saf su bazlı iken asetonitril içinde yapılması gereken numune seyreltme prosedürüdür.

Burada odak nokta, kullanım kolaylığını ve yöntemin genel verimliliğini artırmak için tüm prosedürü basitleştirmek olmuştur.

Toplam GOS içeriği analizi için geliştirilmiş yöntem, başlangıçtaki glikoz, galaktoz ve laktoz konsantrasyonlarının ölçümü için ekstraktı kullanmaktadır (Şekil 1 Deney 1). Ancak, deaktive edilmiş enzim kullanılmamış ve bunun yerine varlığının sonuçlar üzerinde herhangi bir etkisi olup olmadığını görmek için karşılaştırmalar yapılmıştır. Bu adım, AOAC 2001.02 Deney 1'e (deaktive edilmiş enzimle) eşdeğer sonuçlar kanıtlandıktan sonra ortadan kaldırılmıştır, ancak kimyasal masraflar ve ek manuel çalışma azaltılmıştır. Bu nedenle toplam GOS içeriği, Deney 1 (herhangi bir enzim olmadan) ve Deney 2'deki (aktif enzimli ekstrakt) analit konsantrasyonlarından hesaplanmaktadır (Şekil 2).

Uygulama hakkında daha fazla bilgi edinmek ister misiniz? İyon kromatografi ile gıdalarda toplam GOS analizi hakkındaki ücretsiz Uygulama Notumuzu aşağıdaki linkten indirin.

Yeni gıdalar için kalite etiketleri - AOAC 2001.02 metodunda iyileştirme: IC-PAD ile GOS analizi

Enzim kullanımının yanı sıra, toplam GOS'ların analizine yönelik resmi AOAC yöntemi, standartların ultra saf suda (UPW) hazırlanmasını, numunelerin ise %20 asetonitril (ACN) ile seyreltilmesini önermektedir. Sonuçları karşılaştırmak için bir kontrol deneyi gerçekleştirilmiştir:

UPW kalibrasyonu ile değerlendirilen UPW içerisindeki seyreltmeler ("UPW seçeneği")
UPW kalibrasyonu ile değerlendirilen asetonitril içerisindeki seyreltmeler (AOAC 2001.02)
Asetonitril kalibrasyonu ile değerlendirilen asetonitril içerisindeki seyreltmeler ("ACN seçeneği")

Toplam GOS içeriklerinin tekrarlanabilirliği üç seçenek arasında karşılaştırılmış, UPW ve AOAC hazırlama seçenekleri benzer sonuçlar göstermiştir. ACN seçeneğinde diğerlerine göre daha düşük toplam GOS içeriği elde edilmiştir. Ayrıca, asetonitrilin numunelere stabilize edici bir etki yapmadığı da görülmüştür. Bu, asetonitril yerine UPW ile numune seyreltmelerini yaparak, gereksiz reaktiflerden tasarruf edilmesini ve analizin kimyasal etkilerinin sınırlanmasını sağlayarak AOAC yönteminin iyileştirilmesini desteklemektedir.

Sonuçlar

Genel olarak, tatmin edici değişkenlik, hedef ve spike geri kazanımları, girişim testleri ile birlikte modifiye edilen yöntemin değerli ve sağlam olduğunu kanıtlamıştır. Çözelti içerisindeki 0.1 mg/L (galaktoz) ve 0.2 mg/L (glukoz, laktoz) tespit limitleri (LOD) ile düşük seviyedeki toplam GOS içerikleri bile yüksek hassasiyetle belirlenebilmektedir.

Özet

Çok bileşenli bir yöntem olan amperometrik tespitli iyon kromatografi, herhangi bir ek türevlendirme adımı olmaksızın karbonhidratlar için çok seçici, hassas ve sağlam bir analiz yöntemidir. Enzimatik işlemle birlikte daha karmaşık karbonhidratların bile miktarları ölçülebilmektedir.

Bu araştırma, gıda maddelerinde toplam GOS tayini için standart AOAC yöntemine yönelik bir güncelleme sunmaktadır. Aynı prensiple (kompleks GOS moleküllerinin enzimatik hidrolizi ve ardından basit karbonhidratların kromatografik analizi), analitik metot verimliliği laboratuvar süresinden ve işletme maliyetlerinden yana geliştirilmiştir. Ek otomasyon adımları (ör. Metrohm Inline Seyreltme ve otomatik kalibrasyon) metot verimliliğini daha da arttırabilmektedir.

IC-PAD aracılığıyla toplam GOS'lar için basitleştirilmiş yöntem hakkında daha fazla bilgi ister misiniz? Manuel laboratuvar çalışmalarını azaltarak ve pahalı reaktifleri ortadan kaldırarak AOAC 2001.02 metodunun iyileştirilmesi hakkında daha fazla ayrıntıya LC/GC (2021)'den The Column dergisinde yayınlanan makalemizden ulaşabilirsiniz: AOAC 2001.02'nin Geliştirilmesi: HPAEC-PAD Kullanılarak Gıdalarda GOS Tayini.