Analyse von Präbiotika mit IC-PAD: Verbesserung der AOAC 2001.02

Unsere Ernährung ist entscheidend für unsere Gesundheit. In den letzten Jahren hat das Interesse an Lebensmittelzusatzstoffen und Nahrungsergänzungsmitteln wie Präbiotika wie β-Galaktooligosaccharide (GOS) zugenommen. Die Bestimmung des Gesamtgehalts an GOS in Lebensmitteln und Nahrungsergänzungsmitteln ist wichtig, um die strengen Anforderungen an die Lebensmittelkennzeichnung und -sicherheit zu erfüllen. Die am weitesten verbreitete Methode zur Bestimmung des Gesamtgehalts an GOS basiert auf enzymatischer Hydrolyse, um die komplexen Moleküle vor ihrer chromatographischen Analyse in einfache Kohlenhydrate aufzuspalten. Dieser Artikel beschreibt die Vorteile einer Verbesserung der AOAC-Methode 2001.02, die Ionenchromatographie mit amperometrischer Detektion (IC-PAD) und eine vollständige Automatisierung der Proben nach der enzymatischen Hydrolyse verwendet.

Was sind GOS?

GOS sind Ketten von Galaktoseeinheiten mit einem optionalen Glukoseende. Sie sind oft von Natur aus in geringen Mengen in verschiedenen Lebensmitteln und Getränken enthalten.

Ursprünglich wurden GOS als Hauptbestandteile der menschlichen Muttermilch entdeckt (bis zu 12 g/L) und werden als präbiotische Ergänzung zu Säuglingsnahrung hinzugefügt. Sie wirken bifidogen, d. h. sie fördern das Wachstum und das Wohlbefinden nicht-pathogener Darmbakterien.

GOS-Ergänzungen sind entweder roh oder als konzentrierte Pulver oder Sirupe erhältlich und werden von Lebensmittelherstellern zur Anreicherung von Verbraucherprodukten verwendet oder als Nahrungsergänzungsmittel verkauft.

GOS-Kennzeichnungsanforderungen

Das anhaltende Wachstum der weltweiten Märkte für Präbiotika und GOS ist das Ergebnis des zunehmenden Bewusstseins der Verbraucher für eine gesunde Ernährung. Ebenso haben die gestiegenen Anforderungen an die Lebensmittelqualität zu strengeren und umfassenderen Vorschriften für die Kennzeichnung und Sicherheit von Lebensmitteln geführt (z. B. EU 1169/2011 Und EU 2015/2283 ). Um diese Anforderungen zu erfüllen, ist daher die Bestimmung des Gesamtgehalts an GOS in Lebensmitteln, Nahrungsergänzungsmitteln oder Rohprodukten unerlässlich.

Studien über die gesundheitlichen Auswirkungen von GOS empfehlen Höchstmengen von unter 30 g pro Tag, wobei dies für Säuglingsnahrung deutlich strenger ist. Ansonsten gibt es keine weiteren Grenzwerte für den GOS-Gehalt in Lebensmitteln oder als Nahrungsergänzungsmittel.

Abbildung 1. Schema zur Bestimmung des Gesamt-GOS-Gehalts mittels Ionenchromatographie mit gepulster amperometrischer Detektion (IC-PAD) nach AOAC 2001.02 und einer optimierten Methode von Metrohm (in grün). Die Chromatographie für Anionen wird in der AOAC als HPAEC (High Performance Anion Exchange Chromatography) bezeichnet, hier aber vereinfacht mit dem Oberbegriff IC bezeichnet.

AOAC 2001.02

Die am häufigsten verwendete Methode zur Messung der Gesamtmenge an GOS in Lebensmitteln ist die Standardmethode AOAC 2001.02. Diese Methode basiert auf der Extraktion von GOS aus einer Probe, gefolgt von der enzymatischen Hydrolyse der Oligosaccharide in Monosaccharide und deren anschließender Analyse mit Hochleistungs-Anionenaustauschchromatographie mit gepulster amperometrischer Detektion.

In der AOAC wird die Chromatographie für Anionen als HPAEC (High Performance Anion Exchange Chromatography) bezeichnet, aber wir werden dies hier auf den Oberbegriff IC vereinfachen.

Der Schlüssel zu AOAC 2001.02 ist der Vergleich einer Kontrolllösung mit einer Lösung, die mit einem Enzym (β-Galactosidase) behandelt und hydrolysiert wurde. Das Enzym katalysiert die Aufspaltung der glykosidischen Bindungen und hydrolysiert GOS und Laktose in Glukose und Galaktose. Die in diesen beiden Lösungen ermittelten Konzentrationsunterschiede von freier Galaktose und Laktose werden zur Berechnung der Gesamt-GOS verwendet (Abbildung 1).

Abbildung 2. Überlagerte Chromatogramme von Bimuno (präbiotischer Zusatz), unbehandelt (schwarz) und mit Enzym behandelt (orange).

Verbesserungen an der AOAC-Methode

Die Probenvorbereitung für AOAC 2001.02 ist ziemlich komplex: Ein Nachteil ist die Inkubation der Referenzlösung mit dem deaktivierten Enzym (was ziemlich teuer ist) um die anfänglichen Kohlenhydratkonzentrationen zu bestimmen (Abbildung 1), anstatt den reinen Extrakt zu verwenden. Ein weiterer kritischer Punkt ist das Verdünnungsverfahren der Probe, das in Acetonitril durchgeführt werden soll, während die Standards auf Reinstwasser basieren.

Der Schwerpunkt lag hier auf der Vereinfachung des gesamten Verfahrens, um die Benutzerfreundlichkeit und die Gesamteffizienz der Methode zu erhöhen.

Bei der verbesserten Methode zur Analyse des Gesamt-GOS-Gehalts wird der Extrakt zur Messung der Ausgangskonzentrationen von Glucose, Galactose und Lactose verwendet (Abbildung 1 Assay 1). Das deaktivierte Enzym wurde jedoch nicht verwendet, stattdessen wurden Vergleiche angestellt, um festzustellen, ob sein Vorhandensein einen Einfluss auf die Ergebnisse hat. Dieser Schritt wurde eliminiert, nachdem nachgewiesen wurde, dass die Ergebnisse denen des AOAC 2001.02 Assay 1 (mit deaktiviertem Enzym) gleichwertig sind. Damit werden die Kosten an Chemikalien und die zusätzliche manuelle Arbeit werden reduziert. Der Gesamtgehalt an GOS wird daher aus den Analytkonzentrationen in Assay 1 (ohne Enzym) und Assay 2 (Extrakt mit dem aktiven Enzym) berechnet (Abbildung 2).

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Qualitätssiegel für neuartige Lebensmittel – Verbesserung von AOAC 2001.02: GOS-Analyse mit IC-PAD

Abgesehen von der Verwendung von Enzymen schlägt die offizielle AOAC-Methode für die Analyse von Gesamt-GOS vor, dass die Standards in Reinstwasser (UPW) hergestellt werden, während die Proben mit 20% Acetonitril verdünnt werden sollen. Ein Kontrollexperiment wurde durchgeführt, um die Ergebnisse der folgenden Verdünnungs- und Kalibrierungsoptionen miteinander zu vergleichen:

Verdünnungen in UPW, ausgewertet mit UPW Kalibrierung („UPW-Option“)
Verdünnungen in Acetonitril, ausgewertet mit UPW Kalibrierung (AOAC 2001.02)
Verdünnungen in Acetonitril, ausgewertet mit einer Acetonitril Kalibrierung („ACN-Option“)

Die Reproduzierbarkeit des Gesamt-GOS-Gehalts wurde zwischen den drei Optionen verglichen, wobei die UPW- und AOAC-Zubereitungsoptionen ähnliche Ergebnisse lieferten. Die ACN-Option führte zu niedrigeren Gesamt-GOS-Gehalten als die anderen. Außerdem schien Acetonitril keine stabilisierende Wirkung auf die Proben zu haben. Dies spricht für eine Verbesserung der AOAC-Methode durch die Verdünnung der Proben mit UPW anstelle von Acetonitril, wodurch unnötige Reagenzien eingespart und die chemische Belastung der Analyse begrenzt wird.

Ergebnisse

Die modifizierte Methode hat sich aufgrund der konsistenten Variabilität, der präzisen Ziel- und Spike-Wiederfindungsraten sowie der erfolgreichen Interferenztests als nützlich und zuverlässig erwiesen. Mit Nachweisgrenzen (LODs) von 0,1 mg/L (Galactose) und 0,2 mg/L (Glucose, Lactose) in Lösung können selbst geringe Gesamt-GOS-Gehalte mit hoher Präzision bestimmt werden.

Zusammenfassung

Als Mehrkomponentenmethode ist die Ionenchromatographie mit amperometrischer Detektion eine sehr selektive, empfindliche und robuste Analysemethode für Kohlenhydrate ohne zusätzliche Derivatisierungsschritte. In Kombination mit einer enzymatischen Behandlung können auch komplexere Kohlenhydrate quantifiziert werden.

Diese Untersuchung stellt eine Aktualisierung der AOAC-Standardmethode für die Bestimmung von Gesamt-GOS in Lebensmitteln vor. Mit dem gleichen Prinzip (enzymatische Hydrolyse komplexer GOS-Moleküle und anschließende chromatographische Analyse einfacher Kohlenhydrate) wurde die Effizienz der Analysemethode zu Gunsten von Laborzeit und Betriebskosten verbessert. Zusätzliche Automatisierungsschritte (z. B. Metrohm Inline-Verdünnung und automatische Kalibrierungen) können die Effizienz der Methode weiter verbessern.

Möchten Sie mehr über die vereinfachte Methode für Gesamt-GOS mittels IC-PAD erfahren? Weitere Details zur Verbesserung der AOAC-Methode 2001.02 durch die Reduzierung manueller Laborarbeiten und den Verzicht auf teure Reagenzien finden Sie in unserem Artikel, der in der Zeitschrift The Column von LC/GC (2021) veröffentlicht wurde: Verbesserung von AOAC 2001.02: GOS-Bestimmung in Lebensmitteln mit HPAEC-PAD.