AN-P-089
2022-02
パルスアンペロメトリー検出ICによる乳製品中の低濃度ラクトース測定
Fast and robust low level lactose analysis with IC-PAD
概要
世界中で、牛乳および乳製品は人間にとって重要な栄養源です[1]。乳製品には、栄養素、ミネラル、タンパク質、脂質のほか、エネルギー源となる乳糖が主要成分として含まれています。乳糖を効率よく代謝するには、酵素であるラクターゼが不可欠です [2]。しかし、世界全体では人口の約70%が乳糖不耐症であり、乳糖の消化に困難を抱えています[3, 4]。乳糖吸収不良は、消化管症状や消化管外症状、その他の不調をさまざまな程度で引き起こします。乳糖不耐症の人の中には、どのような量にも敏感に反応する人もいれば、少量であれば不調なく摂取できる人もいます。乳糖フリー製品の表示および製造に関する具体的な基準値や規制はいまだ整備されていません。そのため、高感度な標準的手法を用いて食品を正確に分析し、表示することが必要です。パルスドアンペロメトリー検出器を用いたイオンクロマトグラフィー(IC-PAD)により、極めて低い乳糖含有量の測定が可能です。AOAC要件に準拠したバリデーションにより、本法がルーチン分析として高い感度と信頼性を備えていることが示されています。
サンプルとサンプル前処理
乳糖の測定は、乳児用調製粉乳およびフォローアップミルク(AN-P-088)、認証標準物質(例:低乳糖ミルク標準物質 muva ML-2312)、さらにヨーグルト、バター、クリーム、カッテージチーズ、乳飲料、ミルクチョコレート、サプリメントを含む市販の低乳糖製品および乳糖フリー製品15種類など、幅広いサンプルマトリックスを対象に実施しました。
固形物(例:チーズやミルクチョコレート)は細かく刻み、粉末および液体の試料は均質化しました。この前処理の後、試料を適切な容器(0.1~5 g、50 mLポリプロピレン製チューブ)に直接量り取りました。試料の質量(WS(g))は、後の計算のために0.001 g単位まで記録しました。超純水(UPW)を加えて全量を50 mL(WUPW(kg))として、水抽出液を調製しました。その後、バイアルに蓋をして、ボルテックスミキサーで約20秒間激しく混合しました。特定の試料(例:クリームチーズやチョコレート)の溶解性を高めるために、バイアルを70 °Cに温めたウォーターバスで10分間加熱しました。
Carrez沈殿は、分析システムを保護するためにタンパク質や大きな分子を除去する標準的な手法です。この一般的な手順に従って試薬を加え、最終的な質量を記録しました(WUPWc(kg))。十分に混合した後、試料を遠心分離(5000×g)で10分間処理し、上澄みを分取しました。蓋をしたバイアルを、そのままオートサンプラーにセットしました。さらに限外ろ過の工程を追加することで、カラムをより確実に保護できます。
あるいは、低容量透析セルを用いたインライン透析による自動前処理をおすすめします。この場合、試料は先に述べた水抽出液の調製と同様に準備し、よく振り混ぜ、蓋をしてからオートサンプラーのラックに直接セットしました。透析を用いる場合は、分析前のCarrez沈殿が不要となるため、時間と試薬を節約できます。低容量透析セルを使用する場合、必要な試料量は5 mLのみです。
実験
水抽出液中の乳糖量は、分離カラムMetrosep Carb 2 - 250/4.0を用い、等濃度のヒドロキシド溶離液(400 mmol/L NaOH)とスイープ波形を用いたパルスドアンペロメトリー検出(PAD)を組み合わせたイオンクロマトグラフィー(IC)により測定しました(AN-P-088、WP-077)。Metrohm Thin-Layerアンペロメトリックセル(Au作用電極およびPd参照電極)を使用することで、メンテナンスの手間を最小限に抑えながら、電極を長寿命で使用できます。スイープモードと、Thin-Layerセル内の乱れの少ない流れを組み合わせることで、ノイズの少ない滑らかなベースラインが得られます。これは、低乳糖製品など、きわめて低い濃度を分析するために必要な前提条件です。
Carrez沈殿など必須の試料前処理を伴う、乳糖の直接分析のフロースキームを図1に示します。
889 IC Sample Center – coolを使用することで、試料の安定性が向上します。インライン透析による自動試料前処理は、既存のあらゆる構成のセットアップに追加できます。詳細は、Metrohm インライン試料前処理に関するメトロームの資料のほか、AN-P-088にも記載されています。
試料搬送や試料流路の洗浄といった送液作業は、メトロームの最も柔軟な送液ツールであるDosinoを使用して、すべて自動化することもできます。
結果と考察
乳糖は30分以内に溶出します(図2~6)。本法全体の作業範囲は、乳糖液体標準品で0.05~80 mg/L(図2 A)であり、適宜希釈することで0.2~21,000 mg/ 100 gの範囲の試料を分析できます。従来発表されているクロマトグラフィー法とは異なり、プレバイオティクス添加物に由来するものなどの乳糖誘導体(エピラクトース、ラクチュロース、アロラクトース、ガラクトシルラクトース)が乳糖から良好に分離され、本法の選択性と精度が向上しました(図2 B)。
試料濃度は直線検量線(c(Lactose)S(mg/kg))(図2 A)から求め、試料の質量に基づいて計算することで、最終的な乳糖含有量(c(Lactose)FIN(g/ 100 g))を算出します。
A
B
選択した試料のバリデーション結果の例を図3~6 に示します(低乳糖ミルク標準物質(muva)、乳糖とガラクトオリゴ糖を含むサプリメント(Bimuno)、乳糖フリーヨーグルト、乳糖フリーバター)。乳糖濃度は、<0.5 mg/ 100 g(低乳糖バター)から、ほぼ13 g/ 100 g(プレバイオティクスサプリメント)までの範囲でした。このデータは、単一試験室バリデーションにおいて、併行精度および日間変動(RSD ≤7%)、添加回収率(90~110%)、分離度(>1.5、すなわちベースライン分離)に関するAOAC許容基準への適合が確認されたことを示しています。
注入前にCarrez沈殿を用いた分析とインライン透析を用いた分析で得られた結果は、選択した試験試料で同等でした(図3~6、AN-P-088)。短期間の繰り返し測定と添加試験(図3~6に記載)を含む6種類の異なるマトリックスについての結果の差は、RSDで7%未満(平均3.2%)でした。
図3~6 には、短時間内に測定した個別に調製した試料(n = 7)について、平均濃度と併行精度Rr をRSDとして示しています。また、異なる日(4~8日)に測定した個別に調製した試料から求めた濃度(日間変動(RVar) とそのRSD)、および数日間にわたって分析したすべての添加実験の平均としての総添加回収率RS も示しています。乳糖とそれに続くピークとの分離度はRで表しています。選択した試料のインライン透析による結果には、星印(*)を付けています。
| Rr (mg/ 100 g) (RSDr %) | RVar (mg/ 100 g) (RSDVar %) | RS (%) | R |
|---|---|---|---|
| 226 ± 7 (3.2) | 228 ± 12 (5.4) | 102 ± 3 | 2.3 |
| Rr (mg/ 100 g) (RSDr %) | RVar (mg/ 100 g) (RSDVar %) | RS (%) | R |
|---|---|---|---|
| 13009 ± 288 (2.2)* | 13125 ± 484 (3.9)* | 99 ± 6* | 1.9* |
| 11795 ± 130 (1.1) | 11807 ± 465 (3.9) | 99 ± 5 | 1.6 |
| Rr (mg/ 100 g) (RSDr %) | RVar (mg/ 100 g) (RSDVar %) | RS (%) | R |
|---|---|---|---|
| 4.69 ± 0.18 (3.9)* | 4.88 ± 0.05 (2.3)* | 94 ± 3* | 2.6* |
| 4.60 ± 0.15 (3.3) | 4.40 ± 0.05 (1.0) | 96 ± 3 | 2.2 |
| Rr (mg/ 100 g) (RSDr %) | RVar (mg/ 100 g) (RSDVar %) | RS (%) | R |
|---|---|---|---|
| 0.40 ± 0.02 (5.9) | 0.39 ± 0.01 (2.5) | 103 ± 6 | 2.3 |
まとめ
AOAC単一試験室試験の基準に基づくバリデーションにより、低乳糖および乳糖フリーの乳製品中の乳糖を測定する本IC-PAD法が、適切な信頼性、感度、頑健性を備えていることが示されました。Carrez沈殿とMetrohm Inline Dialysisによる試料前処理の比較分析では、非常に高い一致が得られました。Metrohm Inline Dialysisは、Carrez沈殿に代わる時間効率の高い方法としておすすめします。Metrohm ICシステムは高い柔軟性が特長であり、例えば希釈機能を追加するなどのアップグレードが可能で、インライン検量やインテリジェントな希釈にも対応します。自動化により、本法はさらにシンプルになり、ハイスループット分析やルーチン分析にも適したものとなります。
参考資料
- Muehlhoff, E.; Bennett, A.; McMahon, D. 人間の栄養における牛乳および乳製品; FAO: ローマ, 2013.
- Monti, L.; Negri, S.; Meucci, A.; Stroppa, A.; Galli, A.; Contarini, G. 天然の「乳糖フリー」ハードチーズにおける乳糖、ガラクトース、グルコースの測定:HPAEC-PAD法のバリデーション。Food Chem 2017, 220, 18–24. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2016.09.185.
- Bayless, T. M.; Brown, E.; Paige, D. M. ラクターゼ非持続症と乳糖不耐症。Curr Gastroenterol Rep 2017, 19 (5), 23. https://doi.org/10.1007/s11894-017-0558-9.
- Facioni, M. S.; Raspini, B.; Pivari, F.; Dogliotti, E.; Cena, H. 乳糖不耐症の栄養管理:食事と食品表示の重要性。Journal of Translational Medicine 2020, 18 (1), 260. https://doi.org/10.1186/s12967-020-02429-2.
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Internal reference: AW IC CH6-1435-022021
