In tutto il mondo, il latte e i prodotti lattiero-caseari sono fonti di nutrimento vitali per l'uomo [1]. Oltre ai nutrienti, ai minerali, alle proteine e ai grassi, il lattosio è un componente importante dei prodotti lattiero-caseari, fungendo da fonte di energia. Per metabolizzare efficacemente il lattosio, l'enzima lattasi è indispensabile [2]. Tuttavia, a livello globale quasi il 70% della popolazione è intollerante al lattosio, cioè ha difficoltà a digerire il lattosio [3, 4]. Il malassorbimento del lattosio comporta molti sintomi gastrointestinali ed extra intestinali e altri fastidi di diversa portata. Mentre alcune persone intolleranti al lattosio sono sensibili a qualsiasi quantità, altre possono consumarne una piccola quantità senza effetti negativi. Mancano ancora un valore limite specifico e normative per le etichette e la produzione dei prodotti senza lattosio, pertanto è necessario analizzare ed etichettare accuratamente gli alimenti utilizzando tecniche standard sensibili.La Cromatografia ionica con rivelazione amperometrica pulsata (IC-PAD) consente di determinare un contenuto di lattosio molto basso. La convalida secondo i requisiti AOAC mostra l'elevata sensibilità e affidabilità di questo metodo come analisi di routine.
La determinazione del lattosio è stata eseguita per un'ampia selezione di matrici di campioni comprendenti alimenti per neonati e per l'infanzia (AN-P-088), referenze certificate (ad esempio, il latte a basso contenuto di lattosio di riferimento muva ML-2312), nonché 15 prodotti a basso contenuto di lattosio e senza lattosio disponibili in commercio tra cui yogurt, burro, panna, ricotta, bevande al latte, cioccolato al latte e integratori.
I solidi (ad es. formaggio e cioccolato al latte) sono stati tritati, mentre le polveri e i materiali liquidi sono stati omogeneizzati. Dopo questo pretrattamento, i campioni sono stati pesati direttamente in contenitori adatti (provette in polipropilene da 0,1–5 g, 50 mL). Il peso del campione (wS in g) è stato registrato con lo 0,001 g più vicino per i calcoli successivi. Un estratto acquoso è stato preparato aggiungendo acqua ultrapura (UPW) ad un volume totale di 50 ml (wUPW in kg). Successivamente, le fiale sono state tappate e miscelate vigorosamente con un miscelatore a vortice per circa 20 secondi. Per migliorare la solubilità di alcuni campioni (p. es., crema di formaggio o cioccolato), state riscaldate le fiale in un bagno d'acqua temperato a 70 °C per 10 minuti.
La precipitazione di Carrez è un metodo standard per rimuovere le proteine e le molecole più grandi al fine di proteggere il sistema analitico. Seguendo questa pratica comune, sono stati aggiunti i reagenti e annotato il peso finale (wUPWC in kg). Dopo un'accurata miscelazione, i campioni sono stati centrifugati (5000×g) per 10 minuti e decantati. Le fiale coperte sono state inserite direttamente nell'autocampionatore. È possibile ottenere una maggiore protezione della colonna con un ulteriore step di ultrafiltrazione.
In alternativa, è raccomandata la preparazione automatizzata del campione utilizzando la dialisi in linea con la Cella per dialisi a basso volume. Per questo, i campioni sono stati preparati come descritto in precedenza per quanto riguarda gli estratti acquosi, agitati bene e coperti prima di posizionarli direttamente sul rack dell'autocampionatore. Quando si utilizza la dialisi, non è necessaria alcuna precipitazione Carrez prima dell'analisi, risparmiando tempo e sostanze chimiche. L'utilizzo della cella per dialisi a basso volume richiede solo 5 ml di campione.
La quantità di lattosio negli estratti acquosi del campione è stata determinata mediante cromatografia ionica (IC) con la colonna di separazione Metrosep Carb 2 - 250/4.0 utilizzando un eluente di idrossido isocratico (400 mmol/L NaOH) e il rilevamento amperometrico pulsato (PAD) con la forma d'onda di scansione (AN-P-088, WP-077). Una lunga durata dell'elettrodo con requisiti di manutenzione minimi è possibile utilizzando la cella amperometrica Metrohm Thin-Layer (elettrodo di lavoro Au e di riferimento Pd). La modalità di scansione combinata con il flusso meno turbolento nella cella a strato sottile si traduce in una linea di base regolare con basso rumore, è una precondizione necessaria per analizzare concentrazioni molto basse, come nei prodotti a basso contenuto di lattosio.
Gli schemi di flusso per l'analisi diretta del lattosio con la preparazione del campione obbligatoria come la precipitazione di Carrez sono mostrati in Figura 1.
La stabilità del campione è migliorata utilizzando l'889 IC Sample Center – cool. La preparazione automatizzata del campione mediante dialisi in linea può essere aggiunta a qualsiasi configurazione esistente. Maggiori dettagli sono disponibili nella letteratura Metrohm per Preparazione del campione in linea Metrohm così come dentro AN-P-088.
Qualsiasi gestione dei liquidi per il trasporto del campione o la pulizia del percorso del campione può anche essere automatizzata utilizzando lo strumento più flessibile di Metrohm per la manipolazione dei liquidi: il Dosino.
Il lattosio eluisce in meno di 30 minuti (Figura 2–6). L'intervallo di lavoro complessivo del metodo è compreso tra 0,05 e 80 mg/L per standard di lattosio liquido (Figura 2 A), con la capacità di analizzare campioni in un intervallo da 0,2 a 21.000 mg/ 100 g con la rispettiva diluizione. Contrariamente ai metodi cromatografici precedentemente pubblicati, i derivati del lattosio (epilattosio, lattulosio, allolattosio e galattosillattosio), come quelli degli additivi prebiotici, sono stati separati con successo dal lattosio, aumentando la selettività e l'accuratezza del metodo (Figura 2 B).
Le concentrazioni del campione sono determinate dalla calibrazione lineare (c(lattosio)S in mg/kg) (Figura 2 A) e calcolate per determinare il contenuto di lattosio finale (c(lattosio)FIN in g/ 100 g) in base al peso del campione:
UN
B
Esempi di risultati di validazione sono mostrati per campioni selezionati in Figura 3–6 (materiale di riferimento del latte a basso contenuto di lattosio (muva), un integratore contenente lattosio oltre ai galatto-oligosaccaridi (Bimuno), uno yogurt senza lattosio e un burro senza lattosio). Le concentrazioni di lattosio variavano da <0,5 mg/100 g (burro a basso contenuto di lattosio) a quasi 13 g/100 g (integratore prebiotico). I dati mostrano la conformità ai criteri di accettazione dell'AOAC per la ripetibilità e la variabilità giornaliera (RSD ≤7%), i recuperi degli spike (90–110%) e una risoluzione (>1,5, ovvero la separazione della linea di base) accertata all'interno del validazione in laboratorio unico.
I risultati ottenuti per l'analisi utilizzando la precipitazione Carrez prima dell'iniezione e utilizzando la dialisi in linea hanno mostrato risultati comparabili per campioni di test selezionati (Figura 3–6, AN-P-088). I risultati per un insieme di sei diverse matrici comprendenti repliche a breve termine e spike test (come descritto in Figura 3–6) differiscono con RSD inferiori al 7% (media 3,2%).
Figura 3–6 mostrano le concentrazioni medie e la ripetibilità RR come RSD da campioni preparati individualmente misurati in breve tempo tempo (n = 7) o come concentrazione determinata su singoli campioni preparati misurati in giorni diversi (4–8 d) (variabilità giornaliera (RVar) e i loro RSD) e il recupero totale del picco RS come media su tutti gli esperimenti di spike analizzati in diversi giorni. La risoluzione del lattosio a i picchi successivi sono espressi come R. I risultati della dialisi in linea per campioni selezionati sono contrassegnati da un asterisco (*).
| RR (mg/ 100 g) (RSDR %) | RVar (mg/ 100 g) (RSDVar %) | RS (%) | R |
|---|---|---|---|
| 226 ± 7 (3,2) | 228 ± 12 (5,4) | 102 ± 3 | 2,3 |
| RR (mg/ 100 g) (RSDR %) | RVar (mg/ 100 g) (RSDVar %) | RS (%) | R |
|---|---|---|---|
| 13009 ± 288 (2,2)* | 13125 ± 484 (3,9)* | 99 ± 6* | 1,9* |
| 11795 ± 130 (1,1) | 11807 ± 465 (3,9) | 99 ± 5 | 1,6 |
| RR (mg/ 100 g) (RSDR %) | RVar (mg/ 100 g) (RSDVar %) | RS (%) | R |
|---|---|---|---|
| 4,69 ± 0,18 (3,9)* | 4,88 ± 0,05 (2,3)* | 94 ± 3* | 2,6* |
| 4,60 ± 0,15 (3,3) | 4,40 ± 0,05 (1,0) | 96 ± 3 | 2,2 |
| RR (mg/ 100 g) (RSDR %) | RVar (mg/ 100 g) (RSDVar %) | RS (%) | R |
|---|---|---|---|
| 0,40 ± 0,02 (5,9) | 0,39 ± 0,01 (2,5) | 103 ± 6 | 2,3 |
La validità secondo i criteri per un singolo test di laboratorio AOAC mostra l'appropriata affidabilità, sensibilità e consistenza del metodo IC-PAD descritto per la determinazione del lattosio nei prodotti lattiero-caseari a basso contenuto di lattosio e senza lattosio. L'analisi comparativa per la preparazione del campione con precipitazione Carrez e la dialisi in linea Metrohm ha mostrato un'eccellente conformità. La dialisi in linea Metrohm è consigliata come alternativa efficiente in termini di tempo alle precipitazioni di Carrez. I sistemi Metrohm IC sono caratterizzati da un elevato grado di flessibilità: i sistemi possono essere aggiornati, ad esempio, per integrare ulteriormente la diluizione, consentendo anche la calibrazione in linea e la diluizione intelligente. Qualsiasi automazione rende il metodo ancora più semplice e adatto per analisi di routine e ad alto rendimento.
- Muehlhoff, E.; Bennett, A.; McMahon, D. Latte e prodotti lattiero-caseari nella nutrizione umana; FAO: Roma, 2013.
- Monti, L.; Negri, S.; Meucci, A.; Stroppa, A.; Galli, A.; Contarini, G. Determinazione di lattosio, galattosio e glucosio in formaggi a pasta dura naturalmente “senza lattosio”: validazione del metodo HPAEC-PAD. Chimica alimentare 2017, 220, 18–24. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2016.09.185.
- Bayless, T. M.; Marrone, E.; Paige, D. M. Non persistenza della lattasi e intolleranza al lattosio. Curr Gastroenterol Rep 2017, 19 (5), 23. https://doi.org/10.1007/s11894-017-0558-9.
- Facioni, M. S.; Raspini, B.; Pivari, F.; Dogliotti, E.; Cena, H. Gestione nutrizionale dell'intolleranza al lattosio: l'importanza della dieta e dell'etichettatura degli alimenti. Giornale di medicina traslazionale 2020, 18 (1), 260. https://doi.org/10.1186/s12967-020-02429-2.
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