En todo el mundo, la leche y los productos lácteos son fuentes vitales de nutrición para los seres humanos. [1]. Además de los nutrientes, minerales, proteínas y grasas, la lactosa es un componente importante de los productos lácteos y sirve como fuente de energía. Para metabolizar eficientemente la lactosa, la enzima lactasa es indispensable [2]. Sin embargo, a nivel mundial casi el 70% de la población es intolerante a la lactosa, es decir, tiene dificultades para digerir la lactosa. [3, 4]. La malabsorción de lactosa provoca numerosos síntomas gastrointestinales y extraintestinales y otras molestias de diferente magnitud. Si bien algunas personas intolerantes a la lactosa son sensibles a cualquier cantidad, otras pueden consumir una pequeña cantidad sin efectos nocivos. Aún faltan un valor límite específico y regulaciones para las etiquetas y la producción de productos sin lactosa; por lo tanto, es necesario analizar y etiquetar los alimentos con precisión utilizando técnicas estándar sensibles. Cromatografía iónica con detección amperométrica pulsada. (IC-PAD) permite la determinación de contenidos muy bajos de lactosa. La validación según los requisitos de la AOAC muestra la alta sensibilidad y fiabilidad de este método como análisis de rutina.
La determinación de lactosa se realizó para una amplia selección de matrices de muestra que comprenden fórmulas infantiles y alimentos de seguimiento para bebés (AN-P-088), referencias certificadas (por ejemplo, la referencia de leche baja en lactosa muva ML-2312), así como 15 productos comerciales bajos en lactosa y sin lactosa, incluidos yogur, mantequilla, crema, requesón, bebidas lácteas, chocolate con leche y suplementos.
Se picaron los sólidos (por ejemplo, queso y chocolate con leche), mientras que se homogeneizaron los materiales en polvo y líquidos. Después de este pretratamiento, las muestras se pesaron directamente en recipientes adecuados (0,1 a 5 g, tubos de polipropileno de 50 ml). El peso de la muestra (W.S En g) se registró con una precisión de 0,001 g para cálculos posteriores. Se preparó un extracto acuoso agregando agua ultrapura (UPW) a un volumen total de 50 ml (W.UPW en kilogramos). Posteriormente, los viales se taparon y se mezclaron vigorosamente con un mezclador vórtex durante aproximadamente 20 segundos. Para mejorar la solubilidad de determinadas muestras (p. ej., queso crema o chocolate), los viales se calentaron en un baño de agua templada a 70 °C durante 10 minutos.
La precipitación de Carrez es un método estándar para eliminar proteínas y moléculas más grandes con el fin de proteger el sistema analítico. Siguiendo esta práctica común, se agregaron los reactivos y se anotó el peso final (W.UPWc en kilogramos). Después de mezclar bien, las muestras se centrifugaron (5000 xg) durante 10 minutos y se decantaron. Los viales cubiertos se colocaron directamente en el muestreador automático. Se puede lograr una mayor protección de la columna mediante un ultrafiltración paso.
Alternativamente, la preparación automatizada de muestras mediante diálisis en línea con el Celda de diálisis de bajo volumen es recomendado. Para ello, las muestras se prepararon como se describió anteriormente con respecto a los extractos acuosos, se agitaron bien y se taparon antes de colocarlas directamente en el bastidor del muestreador automático. Cuando se utiliza diálisis, no es necesaria la precipitación de Carrez antes del análisis, lo que ahorra tiempo y productos químicos. El uso de la celda de diálisis de bajo volumen requiere solo 5 ml de muestra.
La cantidad de lactosa en los extractos acuosos de la muestra se determinó mediante cromatografía iónica (IC) con un Metrosep Carb 2 - 250/4.0 columna de separación usando un eluyente de hidróxido isocrático (400 mmol/L NaOH) y detección amperométrica pulsada (PAD) con la forma de onda de barrido (AN-P-088, WP-077). Es posible lograr una larga vida útil del electrodo con mínimos requisitos de mantenimiento utilizando la celda amperométrica de capa fina de Metrohm (electrodo de trabajo de Au y electrodo de referencia de Pd). El modo de barrido combinado con el flujo menos turbulento en la celda de capa fina da como resultado una línea base suave con poco ruido, una condición previa necesaria para analizar concentraciones muy bajas, como en productos con bajo contenido de lactosa.
Los esquemas de flujo para el análisis directo de lactosa con preparación de muestra obligatoria, como la precipitación de Carrez, se muestran en Figura 1.
La estabilidad de la muestra se mejora utilizando el 889 IC Sample Center – fresco. La preparación automatizada de muestras mediante diálisis en línea se puede agregar a cualquier configuración existente. Más detalles están disponibles en la literatura de Metrohm para Preparación de muestras en línea Metrohm así como en AN-P-088.
Cualquier manipulación de líquidos para el transporte de muestras o la limpieza del recorrido de las muestras también se puede automatizar utilizando la herramienta más flexible de Metrohm para la manipulación de líquidos: el Dosino.
La lactosa eluye en menos de 30 minutos (Figura 2–6). El rango de trabajo general del método es de 0,05 a 80 mg/L para estándares de lactosa líquida (Figura 2 A), con capacidad de analizar muestras en un rango de 0,2 a 21.000 mg/ 100 g con respectiva dilución. A diferencia de los métodos cromatográficos publicados anteriormente, los derivados de la lactosa (epilactosa, lactulosa, alolactosa y galactosilactosa), como los de los aditivos prebióticos, se separaron con éxito de la lactosa, lo que aumentó la selectividad y precisión del método.Figura 2B).
Las concentraciones de las muestras se determinan a partir de la calibración lineal (c(lactosa)S en mg/kg) (Figura 2 A) y calculado para determinar el contenido final de lactosa (c(lactosa)ALETA en gramos/ 100 gramos) basado en el peso de la muestra:
A
B
Se muestran ejemplos de resultados de validación para muestras seleccionadas en Figura 3–6 (material de referencia de leche baja en lactosa (muva), un suplemento que contiene lactosa además de galactooligosacáridos (Bimuno), un yogur sin lactosa y una mantequilla sin lactosa). Las concentraciones de lactosa oscilaron entre <0,5 mg/100 g (mantequilla baja en lactosa) y casi 13 g/100 g (suplemento prebiótico). Los datos muestran el cumplimiento de los criterios de aceptación de la AOAC en cuanto a repetibilidad y variabilidad diaria (RSD ≤7%), recuperaciones de picos (90–110%) y una resolución (>1,5, es decir, separación de referencia) determinada dentro del único validación de laboratorio.
Los resultados obtenidos para el análisis usando precipitación de Carrez antes de la inyección y usando diálisis en línea mostraron resultados comparables para muestras de prueba seleccionadas (Figura 3–6, AN-P-088). Los resultados de un conjunto de seis matrices diferentes que comprenden réplicas a corto plazo y pruebas de picos (como se describe en Figura 3–6) difieren con RSD inferiores al 7% (promedio 3,2%).
Figura 3–6 mostrar las concentraciones medias y la repetibilidad Rr como RSD de muestras preparadas individualmente medidas en un corto tiempo (n = 7) o como concentración determinada sobre muestras preparadas individuales medidas en diferentes días (4–8 días) (variabilidad de día a día (Rvar) y sus RSD), y la recuperación total del pico RS como promedio de todos los experimentos de picos analizados durante varios días. La resolución de la lactosa a los picos posteriores se expresan como R. Los resultados de la diálisis en línea para muestras seleccionadas están marcados con una estrella (*).
| Rr (mg/100g) (RSDr %) | Rvar (mg/ 100 g) (RSDvar %) | RS (%) | R |
|---|---|---|---|
| 226 ± 7 (3,2) | 228 ± 12 (5,4) | 102 ± 3 | 2,3 |
| Rr (mg/ 100 g) (RSDr %) | Rvar (mg/ 100 g) (RSDvar %) | RS (%) | R |
|---|---|---|---|
| 13009 ± 288 (2,2)* | 13125 ± 484 (3,9)* | 99 ± 6* | 1,9* |
| 11795 ± 130 (1,1) | 11807 ± 465 (3,9) | 99 ± 5 | 1,6 |
| Rr (mg/ 100 g) (RSDr %) | Rvar (mg/ 100 g) (RSDvar %) | RS (%) | R |
|---|---|---|---|
| 4,69 ± 0,18 (3,9)* | 4,88 ± 0,05 (2,3)* | 94 ± 3* | 2,6* |
| 4,60 ± 0,15 (3,3) | 4,40 ± 0,05 (1,0) | 96 ± 3 | 2,2 |
| Rr (mg/ 100 g) (RSDr %) | Rvar (mg/ 100 g) (RSDvar %) | RS (%) | R |
|---|---|---|---|
| 0,40 ± 0,02 (5,9) | 0,39 ± 0,01 (2,5) | 103 ± 6 | 2,3 |
La validez según los criterios de una prueba de laboratorio único de la AOAC muestra la confiabilidad, sensibilidad y solidez adecuadas del método IC-PAD descrito para la determinación de lactosa en productos lácteos bajos en lactosa y sin lactosa. El análisis comparativo para la preparación de muestras con precipitación de Carrez y diálisis en línea Metrohm mostró una conformidad excelente. Se recomienda la diálisis en línea Metrohm como alternativa eficiente en el tiempo a la precipitación de Carrez. Los sistemas Metrohm IC se caracterizan por un alto grado de flexibilidad: los sistemas se pueden actualizar, por ejemplo, para integrar adicionalmente la dilución, lo que también permite la calibración en línea y la dilución inteligente. Cualquier automatización hace que el método sea aún más sencillo y adecuado para análisis de rutina y de alto rendimiento.
- Muehlhoff, E.; Bennett, A.; McMahon, D. Leche y productos lácteos en la nutrición humana; FAO: Roma, 2013.
- Monti, L.; Negri, S.; Meucci, A.; Stroppa, A.; Galli, A.; Contarini, G. Determinación de lactosa, galactosa y glucosa en queso duro naturalmente “libre de lactosa”: Validación del método HPAEC-PAD. química alimentaria 2017, 220, 18-24. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2016.09.185.
- Bayless, T. METRO.; Marrón, E.; Paige, D. METRO. Falta de persistencia de lactasa e intolerancia a la lactosa. Representante Curr Gastroenterol 2017, 19 (5), 23. https://doi.org/10.1007/s11894-017-0558-9.
- Facioni, M. S.; Raspini, B.; Pivari, F.; Dogliotti, E.; Cena, H. Manejo nutricional de la intolerancia a la lactosa: la importancia de la dieta y el etiquetado de los alimentos. Revista de medicina traslacional 2020, 18 (1), 260. https://doi.org/10.1186/s12967-020-02429-2.
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Referencia interna: AWIC CH6-1435-022021