AN-P-088
2021-11
Quality testing for infant formula
Fast and reliable low level lactose determination with IC-PAD
概要
乳糖は、グルコースとガラクトースからなる二糖類で、牛乳および乳製品に含まれています。ヒト母乳中の主要な炭水化物(55～70 g/L)であり、乳児用調製乳の主成分でもあり、最低推奨量は4.5 g/100 kcalです[1]。分析の観点では、このような高濃度であれば、ISO 22184などの多成分分析法や、屈折率検出のような感度の低い方法で容易に測定できます。場合によっては、乳児が乳糖吸収不良を起こすことがあります。この場合、ラクターゼの酵素活性が出生時から制限されているか、または欠如しており、乳糖の代謝が妨げられます。乳糖は小腸でグルコースとガラクトースに加水分解されないため、消化可能な炭水化物が単糖として吸収されることが妨げられます。その結果、多数の消化器症状および腸管外症状や不調(例:下痢)が現れます[1–3]。グルコース・ガラクトース吸収不良症も、人口のごく一部に影響を及ぼします。 あらゆるタイプの吸収不良において、食事由来の乳糖をすべて除去することが重要です。乳糖を含まない栄養源は特に乳児にとって極めて重要であり、これらの食品は規制要件 (乳糖 <10 mg/100 kcal)を適切に満たしている必要があります[1,3–5]。乳児用調製乳のような複雑なマトリックス中の低い乳糖含有量を分析するには、パルスドアンペロメトリー検出を用いたイオンクロマトグラフィー(IC-PAD) が、堅牢で高感度なソリューションとなります。
サンプルとサンプル前処理
乳糖の定量は、乳児用調製乳やフォローアップ用ベビーフードなど、乳糖含有量の低い幅広い試料マトリックスを対象に行われました。対象は、標準物質のNIST 2383a(ベビーフードコンポジット)およびNIST 1869(乳児用調製粉乳)、ヒップ社の乳児用調製乳(HiPP comfort、乳糖低減)、市販の乳糖不使用牛乳(脂肪分1.5%、スパー・スイス)です。
粉末および液体の試料を均質化し、適切な容器(0.1～5 g、50 mLポリプロピレン製遠沈管)に直接秤量しました。後の計算のために、試料の質量(WS、単位:g)を0.001 g単位まで記録しました。超純水(UPW)を加えて全量を50 mLとし、水抽出液を調製しました(WUPW 、単位:kg)。 その後、バイアルに蓋をし、ボルテックスミキサーで約20秒間強く混合しました。
Carrez沈殿法は、分析システムを保護するために、試料からタンパク質や大きな分子を除去する標準的な方法です。この一般的な手順に従って試薬を添加し、最終的な質量を記録しました(WUPWc、単位:kg)。十分に混合した後、試料を遠心分離(5000×g)で 10分間処理し、デカンテーションしました。蓋をしたバイアルを、そのままオートサンプラーにセットしました。追加の限外ろ過工程を加えることで、カラムの保護をさらに高めることができます。
代替法として、低容量透析セルを用いた インライン透析による自動試料前処理が推奨されます。この場合、試料は水抽出液と同様に調製し、よく振とうしてから蓋をして、オートサンプラーラックに置きました。透析では、分析前のCarrez沈殿が不要なため、時間と化学試薬を節約できます。低容量透析セルを使用する場合、必要な試料は5 mL のみです。
実験
水性試料抽出液中の乳糖の量 は、Metrosep Carb 2 - 250/4.0 カラムを用い、等組成の水酸化物溶離液(400 mmol/L NaOH)と、スイープ波形によるパルスドアンペロメトリー検出 (PAD)を用いたイオンクロマトグラフィー(IC)により測定しました(図1)。
Metrohm Thin-Layer アンペロメトリックセル(Au作用電極およびPd参照電極)と組み合わせることで、メンテナンスを最小限に抑えながら、電極寿命を長く保つことができます。スイープモードと、Thin-Layerセル内の乱流の少ない流れにより、滑らかなベースラインが得られます。これは、低乳糖製品のような非常に低濃度の試料を分析するために必要な前提条件です。直接分析の流路図と、Metrohm Inline Dialysis後の分析の流路図を 図2に示します。透析のセットアップはより複雑に見えるかもしれませんが、自動化により、分析プロセス全体を通じて手間をかける価値があります。
結果と考察
乳糖は、直接注入とInline Dialysisのどちらを使用した場合でも、20分以内に溶出します(図3)。これまでに発表されているクロマトグラフィー法とは異なり、プレバイオティクス添加物に由来するような乳糖誘導体(すなわち、エピラクトース、ラクツロース、アロラクトース、ガラクトシルラクトース)が乳糖から良好に分離され、本法の選択性と正確性が向上しました。本法の全体的な作業範囲は、液体の乳糖標準液で0.05～80 mg/Lであり、適切に希釈することで、0.2～21,000 mg/100gの範囲の試料を分析することができます。試料濃度は、直線検量線(c(Lactose)S 、単位:mg/kg)から求められ、試料の質量に基づいて計算して、最終的な乳糖含有量(c(Lactose)FIN 、単位:g/100 g)を算出します。
バリデーション結果を、乳児用調製乳、ベビーフード、牛乳について示します(表1)。これらは、AOACの単一試験室による完全バリデーションの全体的な許容基準(RSDrおよび変動がそれぞれ10%以下および7%以下、添加回収率が分析範囲10～100 mg/100 gでは85～115%、100 mg/100 g超では90～110%)に適合していることを示しています。
注入前にCarrez沈殿を用いた分析(表1)と、Inline Dialysisを用いた分析で得られた結果は、図3に示すように、分析した選択された試験試料において同等でした。このデータは、Carrez沈殿に代わる時間効率の高い方法としてInline Dialysisを使用することの優れた検証となっています。
表1. 乳糖不使用の乳児用調製乳および牛乳試料中の乳糖を、Carrez沈殿による試料前処理後に測定した結果で、乳糖一水和物 (換算係数1.05)として表しています。表には、短期間内に測定した個別に調製した試料(n = 7)のRSDとして求めた繰り返し性Rr、異なる日(4～8日)に測定した個別に調製した試料にわたるRSDとして求めた日間変動、および数日間にわたって分析したすべての添加試験の平均として求めた添加回収率を示しています。
繰り返し性 (mg/100 g) (RSDr、%) | 日間 変動 (mg/100g) (%) | 総添加 回収率 (%) |
|---|---|---|
| NIST 2383a 乳児用食品 (平均 520 ± 27 mg/100 g (n = 7)、目標値 500 ± 100 mg/100 g、回収率 106±6%) | ||
| 520 ± 27 (5.1) | 528 ± 29 (5.5) | 103 ± 2 |
| NIST 1869 乳児用調製粉乳 (平均 569 ± 33 mg/100 g (n = 7)、目標値 520 ± 120 mg/100 g、目標回収率 109 ± 6%) | ||
| 569 ± 33 (5.5) | 523 ± 31 (5.9) | 98 ± 3 |
| HiPP Comfort 乳児用調製乳 (20.8 g/100 g (n = 7)、目標値 22.1 g/100 g、 目標回収率 97 ± 4%) | ||
| 20751 ± 743 (3.6) | 22163 ± 258 (1.2) | 102 ± 3 |
| スパー aha 脂肪分1.5%、乳糖不使用牛乳 | ||
| 2.35 ± 0.18 (7.9) | 2.10 ± 0.05 (2.2) | 111 ± 2 |
まとめ
乳児用調製乳は、あらゆる種類の栄養素(例:タンパク質、脂質、炭水化物、ビタミン、ミネラル)を含むため、非常に複雑で分析が難しいマトリックスです。低濃度の乳糖を測定する際に高い正確性、感度、選択性を保証するには、専用の試料前処理法および分析法が必要です。IC-PADは、自動化されたインライン試料前処理 のオプションによってこのような分析上の課題を克服し、乳糖をその他のマトリックス成分や乳糖誘導体から優れた分離で分析できます。
これらの試料マトリックスにおける推定LOQ 4 mg乳糖/100 gは、乳糖不使用の乳児用調製乳製品に対する要件および既知の閾値を下回っています。したがって、長期分析および添加試験によって示されたように、本法は十分な感度と堅牢性を備えています。さらに、ユーザーのニーズに合わせて応用できる柔軟性、オプションの試料前処理、および自動化により、IC-PADはルーチン分析に最適であり、ラボの分析ポートフォリオに非常に価値のある追加となります。
参考資料
- EFSA. 科学的意見書:乳児用調製乳およびフォローアップミルクの必須組成。Eur. Food Saf. Auth. EFSA J. 2014, 12 (7), 3760.
- Facioni, M. S.; Raspini, B.; Pivari, F.; Dogliotti, E.; Cena, H. 乳糖不耐症の栄養管理:食事と食品表示の重要性。J. Transl. Med. 2020, 18 (1), 260.
- EFSA. 乳糖不耐症およびガラクトース血症における乳糖の閾値に関する科学的意見書。Eur. Food Saf. Auth. EFSA J. 2010, 8 (9), 1777.
- 欧州委員会。乳児用調製乳およびフォローオン調製乳に関する具体的な組成および情報要件、ならびに乳幼児の栄養に関する情報の要件について、欧州議会及び理事会規則(EU)No 609/2013を補足する、2015年9月25日付の委員会委任規則(EU)2016/127。Off. J. Eur. Union 251 2016, 29.
- FAO/WHO. CODEX Alimentarius - 包装済み食品の表示に関する一般規格 CXS 1-1985。 Int. Food Stand.
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Internal reference: AW IC CH6-1435-022021
