Die Lactosebestimmung wurde für eine breite Auswahl an Probenmatrizes durchgeführt, darunter Säuglingsanfangsnahrung und Folgebabynahrung (AN-P-088), zertifizierte Referenzproben (z. B. die lactosearme Referenzmilch muva ML-2312) sowie 15 im Handel erhältliche lactosearme und lactosefreie Produkte, darunter Joghurt, Butter, Sahne, Hüttenkäse, Milchgetränke, Milchschokolade und Nahrungsergänzungsmittel.

Feststoffe (z. B. Käse und Milchschokolade) wurden zerkleinert, während die pulverförmigen und flüssigen Stoffe homogenisiert wurden. Nach dieser Vorbehandlung wurden die Proben direkt in geeignete Gefäße (0,1-5 g, 50 mL Polypropylenröhrchen) eingewogen. Das Probengewicht (W_S in g) wurde für spätere Berechnungen auf 0,001 g genau notiert. Ein wässriger Extrakt wurde durch Zugabe von Reinstwasser (UPW) auf ein Gesamtvolumen von 50 mL (W_UPW in kg) hergestellt. Anschließend wurden die Fläschchen verschlossen und mit einem Vortex-Mixer etwa 20 Sekunden lang kräftig gemischt. Um die Löslichkeit bestimmter Proben (z. B. Frischkäse oder Schokolade) zu verbessern, wurden die Fläschchen 10 Minuten lang in einem auf 70 °C temperierten Wasserbad erhitzt.

Um das Analysensystem zu schützen, ist die Carrez-Fällung eine Standardmethode zur Entfernung von Proteinen und größeren Molekülen. Hierfür wurde den Proben die Carrez-Reagenzien hinzugegeben und das Endgewicht notiert (WUPWc in kg). Nach gründlichem Mischen wurden die Proben 10 Minuten lang zentrifugiert (5000×g) und dekantiert. Die abgedeckten Fläschchen wurden direkt in den Autosampler gestellt. Ein erhöhter Säulenschutz kann durch eine zusätzliche Ultrafiltration der Proben erreicht werden.  

Alternativ kann zur automatischen Probenvorbereitung die Inline-Dialyse mit Low Volume Dialysezelle eingesetzt werden. Dabei werden die Proben wie zuvor beschrieben als wässrige Extrakte vorbereitet, gut geschüttelt und abgedeckt, bevor sie direkt auf den Autosampler gestellt werden. Bei Verwendung der Dialyse ist keine Carrez-Fällung vor der Analyse erforderlich, wodurch Zeit und Chemikalien gespart werden. Bei Verwendung der Low-Volume-Dialysezelle werden nur 5 mL der Probe pro Analyse benötigt.

Lactose eluiert in weniger als 30 Minuten (Abbildung 2-6). Der Gesamtarbeitsbereich der Methode liegt bei 0,05 bis 80 mg/L für flüssige Lactosestandards (Abbildung 2 A), mit der Möglichkeit, Proben in einem Bereich von 0,2 bis 21.000 mg/100 g mit entsprechender Verdünnung zu analysieren. Im Gegensatz zu früher veröffentlichten chromatographischen Methoden konnten Lactosederivate (Epilactose, Lactulose, Allolactose und Galactosyllactose), z. B. aus präbiotischen Zusatzstoffen, erfolgreich von Lactose getrennt werden, was die Selektivität und Genauigkeit der Methode erhöht (Abbildung 2 B).

Die Probenkonzentrationen werden anhand der linearen Kalibrierung bestimmt (c(Lactose)_S in mg/kg) (Abbildung 2 A) und zur Bestimmung des endgültigen Lactosegehalts (c(Lactose)_FIN in g/ 100 g) auf der Grundlage des Probengewichts berechnet:

A

B

Beispiele für Validierungsergebnisse sind in Abbildung 3-6 für ausgewählte Proben dargestellt (lactosearmes Milchreferenzmaterial (muva), ein Nahrungsergänzungsmittel, das neben Galacto-Oligosacchariden auch Lactose enthält (Bimuno), ein lactosefreier Joghurt und eine lactosefreie Butter). Die Lactosekonzentrationen reichten von <0,5 mg/100 g (lactosearme Butter) bis zu fast 13 g/100 g (präbiotischer Zusatz). Die Daten zeigen die Einhaltung der AOAC-Akzeptanzkriterien für die Wiederholbarkeit und die tägliche Variabilität (RSDs ≤7%), die Wiederfindungsraten der Aufstockungen (90-110%) und die Auflösung (>1,5, d.h. die Basislinientrennung), die im Rahmen der Einzellaborvalidierung ermittelt wurden.

Die Ergebnisse für die Analyse mit Carrez-Fällung vor der Injektion und mit Inline-Dialyse zeigten vergleichbare Ergebnisse für ausgewählte Testproben (Abbildung 3-6, AN-P-088).

Bei einer Messreihe von sechs verschiedenen Matrices, einschließlich der kurzzeitigen Wiederholungen und den Aufstockungsversuchen (wie in Abbildung 3-6 dargestellt), variierten die Ergebnisse mit RSDs von weniger als 7 % (durchschnittlich 3,2 %).

In den Abbildungen 3-6 sind die durchschnittlichen Konzentrationen und die Reproduzierbarkeit R_r (als RSD) von einzeln vorbereiteten Proben, die innerhalb kurzer Zeit (n = 7) gemessen wurden, oder als Konzentration, die über einzeln vorbereitete Proben bestimmt wurde, die an verschiedenen Tagen (4-8 d) gemessen wurden (Tagesvariabilität (R_Var) und ihre RSDs), sowie die Wiederfindung R_S der Aufstockungen als Durchschnitt über alle Aufstockungsversuche, die über mehrere Tage analysiert wurden, dargestellt. Die Auflösung der Lactose zu den nachfolgenden Peaks wird als R ausgedrückt. Die Ergebnisse der Inline-Dialyse für ausgewählte Proben sind mit einem Stern (*) gekennzeichnet.

Die beschriebene IC-PAD-Methode zur Lactosebestimmung in lactosearmen und lactosefreien Milchprodukten erfüllt die AOAC-Einzellabortest-Kriterien. Dies beweist ihre Zuverlässigkeit, Empfindlichkeit und Robustheit. Eine Vergleichsanalyse zur Probenvorbereitung mit Carrez-Fällung und Metrohm-Inline-Dialyse zeigte eine hervorragende Übereinstimmung. Als zeiteffiziente Alternative zur Carrez-Fällung empfiehlt sich die Metrohm-Inline-Dialyse. Metrohm IC-Systeme zeichnen sich durch ein hohes Maß an Flexibilität aus. Die Systeme können zum Beispiel mit einer Inline-Verdünnung aufgerüstet werden. Damit ist es möglich neben einer automatischen Verdünnung auch eine Inline-Kalibrierung und logische Verdünnung durchzuführen. Die Automatisierung vereinfacht die Methode für den Anwendenden und ist besonders für Analysen mit hohem Durchsatz und Routineanalysen geeignet.