如何在实验室工作流程中使用近红外光谱
2024年1月8日
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如果将近红外光谱成功整合到您的分析工作流程中，您的实验室将受益于一个快速、准确、无损的日常分析方法。但是，应该如何在实验室工作流程中使用近红外光谱呢？
在近红外光谱系列的第三章节中，我们将通过一个真实的案例来描述在实验室中使用近红外方法的步骤。
让我们先做一些假设：
- 您的企业生产聚合物材料，实验室投资购买了一台近红外光谱分析仪，用于水分的快速测量（替代卡尔费休滴定）和特性粘度的快速测量（替代粘度计）。
- 2) 实验室刚刚收到新的近红外实验室设备，如：一台DS2500近红外光谱分析仪。
步骤1：建立校准集
在本系列的第一章节《什么是近红外光谱》中，我们已经了解到近红外光谱是一种间接分析方法，这意味着需要使用一组与参考方法所测参数值相对应的光谱集来训练您的近红外光谱分析仪。在我们分析水分和特性粘度的案例中，参考方法是卡尔费休滴定法和粘度法，且已知参考方法的测定值。
为了获得稳健可靠的分析方法，训练集中的样本（称为校准集）必须涵盖测试参数的整个预期浓度范围。例如，高效液相色谱法（HPLC）的校准标准曲线就需要涵盖整个预期浓度范围。因此，如果您期望测量的物质水分含量为 0.35% ~1.5% ，则校准集中的样品也必须涵盖这一范围。
首先，使用DS2500 近红外光谱分析仪扫描样品，获得相应光谱；然后，使用软件将近红外测得的样品光谱与参考方法（卡尔费休滴定法和粘度法）测得的相同样品的参数值关联起来。例如，使用瑞士万通 Vision Air Complete 软件包，只需输入水分和粘度值即可（图 2）。随后，这些光谱数据（校准集）将用于预测模型的开发。
需要多少样品或光谱？
校准集中理想的光谱数量取决于样品的变量（粒度、化学分布等）。在本例中，我们使用了10 个聚合物样品，可满足应用可行性检查的要求。
但是，要建立一个稳健的校准集，则需涵盖所有样品变量并确保可靠的定量分析，这就需要更多的样品光谱。通常，在大多数情况下，约 40-50 个样品光谱即可开发出合适的预测模型。
包含 40-50 个光谱的数据集还可用于预测模型的验证。例如，可使用瑞士万通Vision Air Complete 软件包进行操作，该软件包可将数据集分成两组样品：
- 校准集 75%
- 验证集 25%
步骤2：建立和验证预测模型
建立预测模型
覆盖预期值范围的校准集完成测量后，则需建立预测模型，这一步也称为近红外定标模型的开发。不用担心——所有程序均在瑞士万通Vision Air Complete 软件包中全面开发和执行。首先，目测检查每个近红外光谱，找出随浓度变化而变化的区域。通常情况下，数学处理（如，一阶或二阶导数）可以提高光谱差异的可见度（图 3）。
目测检查完成后，软件会将这些选定的光谱区域与来自参考方法的参数值相关联，获得预测模型及模型参数，即校准标准误差（SEC，精确度）和决定系数（R2）。图 4 显示了水分含量的预测模型示例。其它参数（本例中为特性粘度）也采用相同的步骤建立预测模型。
单变量与多变量数据分析
上述过程与 HPLC 的一般工作程序十分相似。使用 HPLC 建立校准曲线时，通常会将峰高或峰强（面积）与已知的内标浓度关联起来。在这种情况下，只使用一个变量（峰高或峰面积），因此这种程序称为单变量数据分析。
而近红外光谱则是一种多变量数据分析技术。近红外光谱利用的是电磁波谱的一个范围（如，水的近红外吸收在1900-2000 nm），因此需要使用多个吸光度值来建立其相关性。
验证预测模型
我们已使用校准集建立了预测模型，现在将使用验证集对预测结果进行验证。这些聚合物样品的验证结果如上图 4 所示。如果您缺乏建立近红外模型的经验，或对建立模型还没有信心，可以依靠以优质服务著称的瑞士万通支持，我们将协助您建立和验证预测模型。
步骤3：日常分析
当完成预测模型的建立和验证后，近红外光谱技术的魅力就会显现出来。现在您只需按下开始按钮，即可一键分析水分含量未知和特性粘度未知的聚合物样品，DS2500近红外光谱分析仪将在一分钟内显示这两个参数的结果。
显示选项
通常只显示结果。如图 5 所示，有时会用黄色或红色框突出显示结果，表示警告或错误。光谱本身并不显示。
当然，也可以选择显示光谱，但对于大多数用户（尤其是轮班工人）来说，这些光谱并没有任何意义，他们也无法从中获得任何信息。在这种情况下，只有数值和明确的合格/不合格指示才是最重要的。
另一种显示方式是趋势图，有助于对生产过程进行自主调整。这里也会突出显示警告限和检测限（图 6）。
总结
在实验室使用近红外光谱技术所需的大部分工作都是在工作流程的开始阶段，即收集和测量整个浓度范围的样品期间。预测模型的建立和验证以及在日常分析中的使用，都可以在瑞士万通Vision Air Complete软件包的帮助下完成，并且可以在很短的时间内完成。此外，如果您需要帮助，瑞士万通的近红外光谱专家很乐意为您提供建立预测模型的相关支持。
值得注意的是，在某些情况下，使用瑞士万通预校准模型则可直接使用近红外光谱仪，而无需开发任何预测模型。这些预校准模型都是基于真实产品光谱而建立的强大、随时可用的操作程序，主要针对于某些应用（如，PET 的粘度）。
我们将在下一章节中介绍并讨论预校准模型的特点和优势：
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