【技術資料】近赤外分光(NIR)法による発酵ブロス中の品質パラメータ5項目の測定

AN-NIR-099

2021-12

【技術資料】近赤外分光(NIR)法による発酵ブロス中の品質パラメータ5項目の測定

Multiparameter determination within one minute

概要

細胞発酵プロセスは、低分子およびタンパク質ベースの医薬品有効成分(API)の信頼性の高い生産方法であり、製薬企業が製造プロセスを最適化し、市場投入までの時間を短縮することを可能にします。発酵プロセスでは、最適な生産を確保するために、さまざまなパラメータのモニタリングが必要です。これらの品質パラメータには、pH、細菌含量、力価、グルコース、還元糖濃度などが含まれます(ただし、これらに限定されません)。従来のラボ分析にはかなりの時間がかかり、発酵プロセスにおけるこれらの品質パラメータをモニタリングするには、種々の異なる分析手法が必要です。

近赤外分光法(NIRS)は、発酵プロセスのあらゆる段階において、発酵液中の重要なパラメータを測定するための、従来の分析手法に代わる、より迅速でコスト効率に優れた手段を提供します。

試験機器

図 1. DS2500 Solid Analyzer

発酵時間の異なる時点で採取した発酵液サンプルを、Metrohm DS2500 Solid Analyzerを用いて透過反射モードで測定しました。サンプルは色が濃い(黄褐色)ため、ゴールド製反射板を使用することなく測定でき、サンプル前処理も必要ありませんでした。すべてのデータ取得および検量線予測モデルの開発には、メトローム社製ソフトウェアパッケージのVision Air Completeを使用しました。

**表 1.** ハードウェアおよびソフトウェア機器の概要
機器	メトローム品番
DS2500 Solid Analyzer	2.922.0010
NIRSトランスフレクションカップ	6.7401.000
NIRSミニサンプルカップホルダー	6.7430.040
Vision Air 2.0 Complete	6.6072.208

DS2500 Solid Analyzer

2.922.0010

ラボおよび生産環境における品質管理用の堅牢な近赤外分光法。DS2500 Analyzerは、生産チェーン全体に沿った固形物、クリーム、およびオプションとしての液体のルーチン分析に実績のあるフレキシブルなソリューションです。頑丈な仕様により、DS2500 Analyzerは粉塵、湿気、振動や温度変動に強い為、過酷な生産環境での使用に理想的です。DS2500は400 ～ 2500 nmのスペクトル範囲全体をカバーし、1分以内に正確で再現性の高い結果を提供します。DS2500 Analyzerは製薬業界の要件を満たしており、簡単な操作により日常的な作業においてユーザーをサポートします。装置に完全に適応した付属品により、　顆粒のような粒の荒い固形物、またはクリームのような半固形液体サンプルなどのあらゆる困難なタイプのサンプルにおいても、最良の結果を得ることができます。固形物の測定においては、9つまでのサンプルのシリーズの自動測定を可能にするMultiSample Cupを使用することで、生産性を高めることができます。

NIRSトランスフレクション容器、オプティカルフラット

6.7401.000

液体のスペクトル測定のためのオプティカルフラットのトランスフレクション容器。以下の装置との組み合わせが可能です:NIRS DS2500 Analyzer (注文番号: 2.922.0010); NIRS XDS MasterLab Analyzer (注文番号: 2.921.1310); NIRS XDS MultiVial Analyzer (注文番号: 2.921.1120); NIRS XDS RapidContent Analyzer (注文番号: 2.921.1110); NIRS XDS RapidContent Analyzer - Solids (注文番号: 2.921.1210);

DS2500 ホルダー

6.7430.040

以下のものに用いられるホルダー:サンプル容器小 (6.7402.030); DS2500 Iris (6.7425.100);

Vision Air 2.0 Complete

6.6072.208

Vision Air - 汎用性に優れた分光法ソフトウェア。Vision Air Complete は、規制環境下での使用のための、操作の容易な最新のソフトウェアソリューションです。Vision Air の利点の概要: 調整済みのユーザーインターフェースを伴う個別のソフトウェアアプリケーションにより、直観的かつ容易な操作が保証されます。; 作業手順の容易な作成およびメンテナンス; 安全かつ容易なデータ管理のための SQL データベース; バージョン Vision Air Complete (66072208) には、可視近赤外分光法を用いた品質管理のための全てのアプリケーションが含まれています: 装置管理およびデータ管理のためのアプリケーション; メソッド開発のためのアプリケーション; ルーチン分析のためのアプリケーション; その他の Vision Air Complete ソリューション: 66072207 (Vision Air Network Complete); 66072209 (Vision Air Pharma Complete); 66072210 (Vision Air Pharma Network Complete);

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結果

得られたVis-NIRスペクトル(図2)は、細菌、グルコース、還元糖の濃度、ならびにpHおよび力価を定量するための検量線予測モデルの作成に使用されました。検量モデルの品質は、Vis-NIRによる予測値と従来分析値との間の高い相関を示す相関図を用いて評価されました。それぞれの統計指標(FOM)は、日常分析における予測の期待される精度を示しています。力価(図7および図8)は、表8に記載されているように、2つの異なるラボ分析法で測定されました。

Vis-NIR spectra of fermentation broth samples taken at different fermentation times and analyzed on a DS2500 Solid Analyzer.

図 2. 発酵時間の異なる時点で採取した発酵液サンプルを、DS2500 Solid Analyzerで分析して得られたVis-NIRスペクトル。

結果　発酵液中のpH

Correlation diagram for the prediction of pH in fermentation broth using a DS2500 Solid Analyzer. The lab value was evaluated using a pH meter.

図 3. DS2500 Solid Analyzerを用いた発酵液中のpH予測の相関図。ラボ値はpHメーターを用いて評価されました。

**表 2.** DS2500 Solid Analyzerを用いた発酵液中のpH予測の統計指標。
統計指標	値
R²	0.6461
検量線標準誤差	0.1645
内的交差確認標準誤差	0.1686
評価用サンプル標準誤差	0.0997

結果　発酵液中の細菌濃度

Correlation diagram for the prediction of bacterial concentration in fermentation broth using a DS2500 Solid Analyzer. The lab value was evaluated using UV-Vis spectrophotometry.

図 4. Figure 4. Correlation diagram for the prediction of bacterial concentration in fermentation broth using a DS2500 Solid Analyzer. The lab value was evaluated using UV-Vis spectrophotometry.

**表 3.**DS2500 Solid Analyzerを用いた発酵液中の細菌濃度予測の統計指標。
統計指標	値
R²	0.7086
検量線標準誤差	4.6884 CFU/mL
内的交差確認標準誤差	4.7429 CFU/mL
評価用サンプル標準誤差	5.0916 CFU/mL

結果　発酵液中のグルコース含量

Correlation diagram for the prediction of glucose concentration in fermentation broth using a DS2500 Solid Analyzer. The lab value was evaluated using HPLC.

図 5. DS2500 Solid Analyzerを用いた発酵液中のグルコース濃度予測の相関図。ラボ値はHPLCを用いて測定されました。

**表 4.** DS2500 Solid Analyzerを用いた発酵液中のグルコース含量予測の統計指標。
統計指標	値
R²	0.9165
検量線標準誤差	0.6938%
内的交差確認標準誤差	0.7896%
評価用サンプル標準誤差	0.8628%

結果　発酵液中の還元糖含量

Correlation diagram for the prediction of reducing sugars in fermentation broth using a DS2500 Solid Analyzer. The lab value was evaluated using HPLC.

図 6. DS2500 Solid Analyzerを用いた発酵液中の還元糖予測の相関図。ラボ値はHPLCを用いて測定されました。

**表 5.** DS2500 Solid Analyzerを用いた発酵液中の糖含量予測の統計指標。
統計指標	値
R²	0.9863
検量線標準誤差	0.4767%
内的交差確認標準誤差	0.6821%
評価用サンプル標準誤差	1.2429%

結果　発酵液中の力価

Correlation diagram for the prediction of potency in fermentation broth using a DS2500 Solid Analyzer. The lab value was evaluated using UV-Vis spectrophotometry.

図 7. DS2500 Solid Analyzerを用いた発酵液中の力価予測の相関図。ラボ値は紫外可視分光光度法を用いて測定されました。

**表 6.** DS2500 Solid Analyzerを用いた発酵液中の力価予測の統計指標。
統計指標	値
R²	0.9083
検量線標準誤差	2295 u/mL
内的交差確認標準誤	2968 u/mL
評価用サンプル標準誤差	2089 u/mL

結果　発酵液中の力価

Correlation diagram for the prediction of potency in fermentation broth using a DS2500 Solid Analyzer. The lab value was evaluated using HPLC + PCR.

図 8. DS2500 Solid Analyzerを用いた発酵液中の力価予測の相関図。ラボ値はHPLC + PCRを用いて測定されました。

**表 7.** DS2500 Solid Analyzerを用いた発酵液中の力価予測の統計指標。
統計指標	値
R²	0.9156
検量線標準誤差	1913 u/mL
内的交差確認標準誤差	2172 u/mL
評価用サンプル標準誤差	1168 u/mL

まとめ

本アプリケーションノートは、近赤外分析(NIR)法を用いて発酵プロセスの品質管理における主要パラメータを測定できる可能性を示しています。Vis-NIR分光法が従来の湿式分析手法に対して持つ主な利点は、ランニングコストが大幅に低く、結果が得られるまでの時間が大幅に短縮されることです。さらに、化学薬品が不要であり、この近赤外分析(NIR)法はサンプルを非破壊で測定可能です。

**表 8.** 各品質パラメータの結果取得までの時間の概要
パラメータ	方法	結果取得までの時間
pH	pHメーター	約3–5分
細菌濃度	UV-Vis	約8時間(サンプル前処理)+約1分(UV-Vis)
グルコースおよび還元糖濃度	HPLC	約30～45分
力価	UV-Vis	約7分(サンプル前処理)+約1分(UV-Vis)
力価	HPLC + PCR	約1時間(サンプル前処理)+約20分(HPLC + PCR)