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ラマン分光計による微生物の迅速な同定と代謝物検出

AN-RS-047

2025-06

ja

細菌分析のための簡単で非破壊的な分析方法

ラマン分光法は細菌同定や培養によって生成される代謝物の検出に有望なツールとなりえ、生物プロセスや生態系における機能への深い洞察を可能にします。

微生物は地球上で最も多様な生命体の一つです。それらは独自の特性を示し、生態系の栄養素および物質循環において重要な役割を果たします。微生物はヨーグルトやアルコール飲料を含む食品生産や環境汚染物質の浄化に不可欠です。さらに、微生物の遺伝子改変はインスリンのような貴重な製品の生産を促進します。その重要性を考慮し、多くの国が微生物を保存し蓄積するために、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)やスイス微生物コレクション(SCM)などの専門的な機関を設置し、それを維持しています。

従来、細菌などの微生物の同定には遺伝子構成のシーケンシングを用いていました。このプロセスには専門的な訓練と高価な設備が必要です。しかし、ラマン分光法は細菌同定や培養によって生成される代謝物の検出に有望なツールとなりえ、生物プロセスや生態系における機能への深い洞察を可能にします。メトロームのラボ用ラマン分光計には、細菌培養計測用の785 nmおよび1064 nmラマンオプションが用意されています。

ラマン分光法は、細菌の同定や代謝物のモニタリングの可能性から微生物学で広く使用されています。地球上のすべての生物は、炭素、水素、酸素、窒素、リン、硫黄、およびその他の微量元素で構成されています。これらの元素は結合してDNA、脂質、アミノ酸、その他の生体分子を形成します。これらの生体分子の組成は生物間で異なります。一部の細菌は環境条件に応じて代謝物(例:ポリリン酸やグリコーゲン)を蓄積します。細菌のラマンスペクトルはこれらの化学的差異を反映し、それらの同定と生物プロセスにおける役割の解明を可能にします。

リソジェニーブロス(LB)寒天培地は、メーカー(シグマアルドリッチ)仕様に従い、LB粉末と寒天粉末を脱イオン水に溶解して調製しました。オートクレーブ後、混合物を滅菌したガラスペトリ皿に注ぎ、冷却しました。LB寒天が固化したら、指を表面に押し付けて細菌を培地に移しました。その後、ペトリ皿を室温で培養し、細菌コロニーが観察されるまで待ちました。

ペトリ皿をBAC150BプローブホルダーとBAC151Cビデオ顕微鏡下に置き、コロニーと培地からのラマンスペクトルを測定しました(図1)。機器構成と測定パラメータは表1に示しています。

図1. LB寒天上に形成された細菌コロニー(a)、BAC151C + 50x対物レンズ下でのコロニーの拡大図(b)

細菌コロニーのラマンスペクトル(図2)には、さまざまなアミノ酸(1001、1156、および1654 cm-1)およびDNA(723、669、および1337 cm−1)を表すピークが含まれていました。これらの特徴は細菌で一般的に観察され、i-Raman Prime 785の微生物分析が可能なことを示唆しています[1]。

表1. 本研究で使用した機器構成と測定パラメータ

* 測定パラメータはコロニーの特性に応じて異なります。

機器構成 プローブホルダー
(BAC150B)
ビデオ顕微鏡
(BAC151C)
i-Raman Prime 785 BAC102-785HT 50x objective
i-Raman EX BAC102-1064HT 50x objective
BWSpecソフトウェア
測定パラメータ*
レーザー出力 (%) 30–100
積算時間 3–60 s
平均回数 3–5
図2. i-Raman Prime 785(ブルーライン)及びi-Raman EX(グリーンライン)を使用して測定されたLB寒天上に形成された細菌コロニーのラマンスペクトル。報告された特徴に対応するラマンピークは点線で示され、右の表に割り当てられています[1]。

細菌コロニーのラマンスペクトル(図2)には、さまざまなアミノ酸(1001、1156、および1654 cm-1)およびDNA(723、669、および1337 cm−1)を表すピークが含まれていました。これらの特徴は細菌で一般的に観察され、i-Raman Prime 785の微生物分析が可能なことを示唆しています[1]。

785 nmレーザーでのラマン励起は、1064 nmレーザーでの励起よりも強く鋭いピークを示しました。これは、785 nmレーザーの散乱力が高く、シリコンCCD検出器の解像度がピクセル密度が低いInGaAsアレイ検出器よりも優れていることに起因しています。しかし、一方、1064nmレーザーの励起はチョコレート寒天や血液寒天などの着色寒天(暗色基板)に関連する蛍光を軽減できるという利点があります。

図3. LB寒天上に形成された黄色(ブルーライン)および白色(グレーライン)の細菌コロニーのラマンスペクトル。スペクトルはベースライン補正されています。点線内に示されたラマンピークは、その特定のコロニーの黄色に関連している可能性があります。

LB寒天上に2つの異なる形態(白色と黄色)の細菌が形成され、異なる生物であることが示唆されます(図3)。これら2つの細菌のラマンスペクトルは著しく異なり、黄色の細菌は植物や微生物に一般的に見られる色素に関連するピークを示しました[1]。

図4. LB寒天上に形成された白色および黄色のコロニーから収集されたラマンスペクトルのPCAプロット。信頼区間:0.95。

主成分分析(PCA)は、この実験のように小さな細菌群集において、異なる表現型特徴を持つ細菌を識別するのに適している可能性があります(図4)。しかし、研究者は通常、より詳細な特性評価のために、マイナーピークの微妙な違いを検出する機械学習アルゴリズムを使って解析します。

  • ガラスペトリ皿を使用することで、プラスチックからのスペクトル寄与を回避できます。
  • コロニーのラマンスペクトルは、低温保存および長期間の培養後に変化する可能性があります。
  • ビデオ顕微鏡は、1064 nmレーザー励起を使用してレーザースポットを可視化します。

ラマン分光法は、固体培地から直接細菌コロニーのスペクトルを取得するために使用できます。785nmレーザー励起で測定されたラマンスペクトルは高い解像度が得られ、1064nmレーザー励起は培地からの蛍光を低減させることができます。

単純な細菌コロニーはPCAモデルを使用して識別できますが、より複雑な微生物群集を特性評価するために高度な機械学習アルゴリズムを使用することができます。

ユーザーはi-Ramanラマン分光計からスペクトルファイルを簡単にエクスポートし、BWSpecソフトウェアやその他の高度な機械学習ツールを使用して更なる分析を行うことが可能です。

  1. Paret, M. L.; Sharma, S. K.; Green, L. M.; et al. Biochemical Characterization of Gram-Positive and Gram-Negative Plant-Associated Bacteria with Micro-Raman Spectroscopy. Appl Spectrosc 2010, 64 (4), 433–441. DOI:10.1366/000370210791114293
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