AN-EC-039
2026-04
Estudo de espectro-eletroquimiluminescência da emissão simultânea de dois luminóforos
Monitoramento por ECL do sistema de transferência de energia por ressonância (RET) formado por luminol e fluoresceína
Introdução
A quimiluminescência eletrogerada, ou eletroquimiluminescência (ECL), é a emissão de luz proveniente de estados excitados gerados por reações de transferência de elétrons na superfície do eletrodo.
Essa técnica oferece vantagens como alta versatilidade, excelente sensibilidade e um dispositivo compacto e portátil. Além disso, a ECL permite controle temporal e espacial preciso da reação [1,2].
Esta Nota de Aplicação descreve a resposta de ECL quando mais de um luminóforo está presente em uma solução.
ECL do luminóforo luminol
A excitação eletroquímica de 0,002 mol/L de luminol na presença de 0,05 mol/L de peróxido de hidrogênio em tampão PBS 0,1 mol/L (pH 8) é realizada por voltametria de varredura linear, de 0,00 V a +1,00 V, a 0,05 V/s.
O detector fotodiodo integrado ao ECLPHOTODIODCELL registra o sinal total de ECL, porém não fornece resolução de comprimento de onda.
Esse detector é altamente sensível, permitindo a detecção de concentrações muito baixas do luminóforo em estudo.
Como pode ser observado na Figura 2, o voltamograma de varredura linear (linha azul) mostra um pico de oxidação em 0,30 V, correspondente à oxidação eletroquímica do luminol na presença de peróxido de hidrogênio. Isso também gera a emissão de luz em 425 nm, registrada pelo fotodiodo como emissão total de luz (linha verde). Os picos de ECL e eletroquímico coincidem exatamente em 0,30 V.
O sinal de ECL do luminol na presença de peróxido de hidrogênio apresenta seu comportamento característico, com a intensidade de emissão aumentando durante a oxidação do luminol [3,4].
Repetindo o experimento com o microespectrômetro como detector, observa-se a mesma resposta eletroquímica (linha azul, Figura 2), mas a resposta óptica é diferente, já que o microespectrômetro diferencia os comprimentos de onda. O espectro registrado apresenta uma única banda de emissão em 425 nm, como visto na Figura 3a.
A evolução da emissão em 425 nm em função do potencial pode ser obtida utilizando a ferramenta «Spectra vs EC» no DropView SPELEC. Como pode ser visto na Figura 3b, o comportamento da ECL coincide exatamente com a resposta de ECL obtida pelo detector fotodiodo (linha verde, Figura 2). A emissão de ECL atinge o máximo quando o pico de oxidação do luminol em 0,30 V é observado eletroquimicamente.
ECL dos luminóforos luminol e fluoresceína
O sistema de transferência de energia por ressonância (RET) formado pelos luminóforos luminol (doador) e fluoresceína (aceptor) [5] é estudado. De acordo com o mecanismo de RET, o luminol gera luminescência ao sofrer oxidação eletroquímica na presença de peróxido de hidrogênio. Parte dessa luz emitida atua como fonte de excitação para a fluoresceína, que reemite luz em um comprimento de onda diferente.
A análise desse sistema utilizando o ECLPHOTODIODCELL fornece as respostas eletroquímica (linha azul) e de ECL (linha verde) mostradas na Figura 4. Como apenas o luminol sofre oxidação eletroquímica, o voltamograma é idêntico ao obtido sem fluoresceína (Figura 2). O detector fotodiodo registra um aumento na intensidade total de ECL durante a oxidação do luminol em 0,30 V. Porém, como o fotodiodo não registra os espectros de emissão, ele não consegue distinguir as contribuições do luminol e da fluoresceína.
Ao repetir o experimento utilizando a célula microespectrômetro, o comportamento eletroquímico permanece o mesmo (linha azul, Figura 4), mas a ECL apresenta duas bandas de emissão. A Figura 5a mostra os espectros registrados durante a voltametria de varredura linear. A banda em 425 nm corresponde à emissão do luminol, enquanto a banda em 530 nm está associada à emissão da fluoresceína. Isso confirma a RET do luminol para a fluoresceína e demonstra a capacidade do microespectrômetro de diferenciar as emissões de diferentes luminóforos.
A evolução das emissões em função do potencial é analisada utilizando a ferramenta «Spectra vs EC» no DropView SPELEC. Como pode ser observado na Figura 5b, as emissões do luminol e da fluoresceína aumentam durante a oxidação do luminol e atingem seus máximos em 0,30 V. A resposta de espectro-eletroquimiluminescência também permite avaliar a contribuição de cada luminóforo, mostrando que a emissão do luminol é maior que o sinal da fluoresceína.
Conclusão
O sistema de ECL formado pelo luminol como luminóforo e peróxido de hidrogênio como co-reagente, assim como o sistema de ECL por RET baseado em dois luminóforos, luminol e fluoresceína, com peróxido de hidrogênio como co-reagente, foram estudados utilizando o SpectroECL com dois detectores diferentes.
O detector fotodiodo não discrimina entre comprimentos de onda e registra a intensidade total de luminescência para cada ponto eletroquímico. A célula fotodiodo é muito útil para a detecção de concentrações muito baixas do luminóforo em estudo e para pesquisas com apenas uma espécie marcadora.
Por outro lado, o detector microespectrômetro fornece resolução de comprimento de onda e permite a realização de experimentos de espectro-eletroquimiluminescência, já que os espectros visíveis são registrados simultaneamente ao sinal eletroquímico. Essa célula é útil para sistemas multianalito, desenvolvimento de novos luminóforos e caracterização de propriedades de materiais.
Referências
- Richter, M. M. Electrochemiluminescence (ECL). Chem. Rev. 2004, 104, 3003–3036. https://doi.org/10.1021/cr020373d.
- Hu, L.; Xu, G. Applications and Trends in Electrochemiluminescence. Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 3275–3304. https://doi.org/10.1039/b923679c.
- Ballesta-Claver, J.; Valencia-Mirón, M. C.; Capitán-Vallvey, L. F. Disposable Electrochemiluminescent Biosensor for Lactate Determination in Saliva. Analyst 2009, 134, 1423–1432. https://doi.org/10.1039/b821922b.
- Yildiz, G.; Tasdoven, U.; Menek, N. Electrochemical Characterization of Luminol and Its Determination in Real Samples. Analytical Methods 2014, 6, 7809–7813. https://doi.org/10.1039/C4AY01281J.
- Neves, M. M. P. S.; Bobes-Limenes, P.; Pérez-Junquera, A. et al. Miniaturized Analytical Instrumentation for Electrochemiluminescence Assays: A Spectrometer and a Photodiode-Based Device. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2016, 408, 7121–7127. https://doi.org/10.1007/s00216-016-9669-7.
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