トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、別名TRIS、THAM、トロメタミン）は、ライフサイエンス分野における緩衝液の一般的な成分です。pH 7.2〜9.0の範囲で高い緩衝能を持ち、20℃におけるpKaは8.2です。また、金属イオンと錯体を形成するため、トリスは生化学や分子生物学の用途に最適です［1］。トリス緩衝液は、DNA精製、SDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によるタンパク質分離、またはゲル電気泳動による核酸分離に使用されます［2］。さらに、トリスは代謝性アシドーシスの治療にも用いられ、非イオン化形態で細胞膜を透過できるため、細胞内緩衝剤としても機能します［3］。これらの理由から、特に製薬分野での使用にあたっては、トリスの純度管理が非常に重要です。
Metrosep C Supp 2 - 250/4.0カラムとメタン酸（MSA）溶離液を用いた堅牢ななアイソクラティック・イオンクロマトグラフィー（IC）法は、トリスおよびカチオン性不純物の測定に理想的な方法です。この microbore IC system (MB) は、MSA溶離液に対して感度が高く安定したIC導電率検出器MBを搭載しており、低空隙容量、分析システムの長期安定性、およびトリス定量における高精度な結果をもたらします。
サンプルは、分析試薬（p.a.）品質のTrizma®ベース (TRIS) (CAS番号77-86-1) 粉末から調製しました。方法評価のため、2種類の異なるTRIS濃度（10.37 mg/Lおよび103.7 mg/L）を溶離液（0.1％メタン酸）に溶解しました。
マイクロボアイオンクロマトグラフ 930 コンパクトIC Flex オーブン/DEG/MBは、メタン酸 (MSA) に対して安定なIC導電率検出器MBを搭載しており（図1）、ノンサプレッサー型の測定系として、0.1％（v/v）（15 mmol/L）のメタン酸（MSA）を含む溶離液が使用されました (表1を参照)。サンプルはMetrosehのインテリジェント部分ループ注入技術（MiPT、図2）を用いて注入されました。この技術では、250 μLのサンプルループに正確に計量された、自由に選択可能な体積（本検討では5〜40 μL）が充填されます。注入量の精密な制御は、2 mLドージングユニットを備えたDosinoにより行われます。MiPTにより、単一の標準液から校正を行うことが可能であり、本試験では5〜140 mg/LのTRIS範囲で校正が実施されました。
可変注入量の選択は、サンプル注入にも適用可能です。そのような場合、例えば高濃度の試料に対しては、手動による希釈工程を省略するために少注入量を選択します。
典型的な無機カチオン（リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム）をMetrosep C Supp 2カラムに注入し、共溶出の可能性がないか確認しました。
| カラム | Metrosep C Supp 2 - 250/4.0 |
|---|---|
| 溶離液／希釈液 | c(MSA) = 0.1 % (v/v) |
| 流量 | 1.0 mL/min |
| 温度 | 30 °C |
| 注入量 | 5–40 µL (MiPT) |
| 検出器 | 電気伝導度検出器 |
TRISの定量は、MB ICシステムを用いたアイソクラティック測定により8分未満で行われます。前述の通り、本手法は主要なカチオンに関して干渉がないことが確認されています。
ナトリウムの保持時間は4.1分でした。例えばカラム温度を20℃に下げるなど、測定条件を変更することで、ナトリウムとTRISの分離能を向上させることが可能です。本研究で用いた測定条件（表1）では、ピーク高を評価指標として用いることで、精密な定量が可能です。100 mg/LのTRISにおける回収率は99〜103％で、相対標準偏差は3％未満であり、本法の高い精度が示されました。
医薬品産業で使用される原材料である溶液やバッファーは、その正確な濃度および純度に関して、最高水準の品質基準を満たさなければなりません。
本応用研究の測定系は、マイクロボアイオンクロマトグラフィーシステム、MSAに対して安定な導電率検出器、および単一標準液による自動校正と柔軟な試料注入量の選択を可能にするMiPTを組み合わせたものです。本手法は、5〜200 mg/Lの範囲でTRISの定量に適しており、一般的なバッファー成分であるTRISを簡便かつ精密に、かつ安定して測定することを可能にします。
- Deutscher, M. P. Guide to Protein Purification; Gulf Professional Publishing, 1990.
- Westermeier, R. Electrophoresis in Practice: A Guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations; John Wiley & Sons, 2016.
- Sirieix, D.; Delayance, S.; Paris, M.; et al. Tris-Hydroxymethyl Aminomethane and Sodium Bicarbonate to Buffer Metabolic Acidosis in an Isolated Heart Model. Am J Respir Crit Care Med 1997, 155 (3), 957–963. https://doi.org/10.1164/ajrccm.155.3.9117032.
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