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La segunda parte de esta serie de blogs sobre las mejores prácticas para las columnas de separación de circuitos integrados se centra en temas relacionados con la aplicación que tienen un impacto en la idoneidad y la estabilidad de la columna. En primer lugar, está la elección adecuada de la columna que mejor se adapte a la aplicación prevista. Luego pasamos a los parámetros operativos que se pueden modificar para optimizar la separación entre analitos, y cuáles son los respectivos efectos y posibilidades.
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Elección de la longitud y el diámetro de la columna
Metrohm ofrece una amplia gama de columnas IC que contienen diferentes fases estacionarias y tienen diferentes longitudes y/o diámetros internos. La elección de la fase estacionaria tiene un gran impacto en la selectividad entre los analitos individuales por un lado, así como en la estabilidad frente a diferentes matrices de muestra por otro lado. En cambio, la longitud de la columna no tiene impacto en la selectividad, sino más bien en la eficiencia de separación entre los picos individuales.
Obtenga más información sobre la amplia selección de columnas de separación de Metrohm para cromatografía iónica en nuestro Catálogo de columnas.
Efectos de la longitud de la columna
En los siguientes cromatogramas (Figura 1), el efecto de la longitud de la columna sobre la eficiencia de separación para el Serie de columnas Metrosep A Supp 17 se muestra. Siempre que elija una longitud de columna, debe tener en cuenta la complejidad de la separación prevista y la presencia de componentes de la matriz que podrían perturbar los iones de interés.
Efectos del diámetro de la columna
Además de proporcionar diferentes longitudes de columnas de separación de circuitos integrados, Metrohm también ofrece la mayoría de las columnas tanto en 4mm diámetro interior y 2 milímetros versiones de diámetro interior (conocido como «microbore»). Al respecto, existen varios criterios a distinguir:
- Si utiliza sistemas en línea en un modo continuo (es decir, sistemas que funcionan sin supervisión durante varios días seguidos, como Metrohm Process Analytics sistema MARGA – METROmonitor para AmiRosoles y GRAMOases en Aaire ambiente), recomendamos utilizar columnas IC de 2 mm. Debido al caudal reducido de las columnas microbore (solo el 25 % del caudal de las columnas de 4 mm), el eluyente y las soluciones regenerantes duran mucho más, lo que aumenta el tiempo que se puede dejar el instrumento desatendido.
- Hay aplicaciones que requieren técnicas con guión como IC-MS para una mayor sensibilidad y selectividad de analitos. En este caso, el uso de columnas de 2 mm es ideal. El caudal bajo es óptimo para el proceso de electropulverización y, por lo tanto, no se requiere un divisor de flujo antes de entrar en el espectrómetro de masas.
- A veces, solo se dispone de una cantidad limitada de muestra para inyección. En estas situaciones, se prefieren columnas de 2 mm. Esto se debe a que se produce menos dilución/difusión durante el proceso de separación y, por lo tanto, se obtienen señales más altas.
- Por otro lado, si su muestra contiene una gran cantidad de componentes de la matriz, seleccionar columnas IC de 4 mm adecuadas será una mejor opción debido a la mayor capacidad disponible para separar los analitos deseados de la matriz.
Obtenga más información sobre MARGA y sus capacidades para el monitoreo continuo de la calidad del aire en nuestra publicación de blog.
Optimización de la separación de analitos
Junto a la propia columna, se pueden modificar varios otros parámetros para optimizar la selectividad de la separación. Estos parámetros incluyen la temperatura, los componentes y la concentración del eluyente y los modificadores orgánicos.
Efectos de modificar la temperatura
Una de las formas más sencillas de ajustar la selectividad de separación en IC es modificando la temperatura del análisis. Esto se logra utilizando el horno de columna integrado en el instrumento (si está disponible). Se pueden observar múltiples efectos, por ejemplo, en el análisis de aniones. Como ejemplo, el impacto de la temperatura en la selectividad se muestra en la superposición del cromatograma (Figura 2) Para el Línea de columna Metrosep A Supp 17.
- Los iones monovalentes como el fluoruro, el cloruro, el nitrito, el bromuro y el nitrato se aceleran con el aumento de la temperatura, lo que indica que ocurren menos interacciones con la fase estacionaria.
- El comportamiento de los iones multivalentes como el fosfato o el sulfato es más complicado de describir y variará con cada fase estacionaria. En general, los iones multivalentes se retardan más a temperaturas más altas, lo que hace que aumenten los tiempos de retención, como se puede ver para el sulfato. El fosfato, por otro lado, se comporta de manera diferente, debido al cambio inducido por la temperatura del pH del eluyente en un rango cercano al pKa valor del fosfato. Debido a este cambio de pH, la carga efectiva del ion fosfato también cambia (en este ejemplo, la carga efectiva se reduce al aumentar la temperatura).
- La forma del pico de los iones polarizables, como nitrito, bromuro y, en particular, nitrato, es Mejorado significativamente a temperaturas más altas. La razón de este comportamiento es la reducción de las interacciones secundarias con la fase estacionaria.
Efectos de la modificación de la composición y concentración del eluyente
La composición y la fuerza del eluyente se pueden usar para cambiar el orden de elución de varios analitos mientras se usa la misma columna de separación. En cromatografía de cationes, PR desarrolló un modelo de retención Haddad y PE Jackson, que permite a los investigadores predecir los tiempos de retención al cambiar la composición del eluyente [1].
Teniendo en cuenta que la columna permanece idéntica en cada determinación, no se espera ningún cambio en el equilibrio de intercambio iónico ni en la capacidad de la columna. Por lo tanto, al cambiar sólo la concentración de eluyente, se puede utilizar la siguiente correlación:
Donde:
- k' es el factor de retención del analito de interés
- C es una constante
- X es la carga del analito
- y es la carga del eluyente
- miy+METRO es la concentración del eluyente en la fase móvil
Si se usa ácido nítrico como eluyente, y = 1, y el modelo se puede simplificar a:
Aplicar esta fórmula a situaciones prácticas en el laboratorio significa lo siguiente: al aumentar la fuerza del eluyente, los metales alcalinotérreos se aceleran mucho más rápido (X = 2) en comparación con los metales alcalinos (X = 1), por lo que es posible eluir el magnesio antes que el potasio. Este efecto se llama electroselectividad.
Los iones de metales multivalentes son capaces de formar complejos con agentes complejantes dedicados. Por tanto, las selectividades se pueden modificar añadiendo agentes complejantes al eluyente. Como ejemplo, el ácido dipicolínico (DPA) se usa a menudo para complejar el calcio, lo que conduce a una reducción de la carga efectiva de calcio. Como consecuencia, el tiempo de retención del calcio se reduce y el calcio eluye antes que el magnesio en el cromatograma (figura 3).
La retención de cationes monovalentes puede verse influenciada por la adición de éter corona a la fase móvil.
Los sistemas de aniones son más complejos con respecto al modelo de tiempo de retención, aunque se puede observar el mismo efecto de electroselectividad hasta cierto punto para los aniones. Sin embargo, al cambiar la fuerza del eluyente, el pH del eluyente también cambia con frecuencia, lo que conduce a diferentes equilibrios de desprotonación de aniones multivalentes (p. ej., fosfato). Esto influye en la carga efectiva del analito y, al hacerlo, también influye en su retención de forma similar a la descrita anteriormente para los efectos del cambio de temperatura.
En algunos casos, el uso de una pequeña cantidad de un modificador orgánico como metanol, acetonitrilo o acetona en el eluyente puede tener sentido:
- Si la contaminación bacteriana ha sido un problema antes, la adición de un 5 % de metanol al eluyente puede ayudar a prevenir el crecimiento bacteriano en el futuro.
- Cuando es necesario inyectar muestras que contienen una gran cantidad de disolvente(s) orgánico(s) y no es necesario un tratamiento previo de la muestra, como extracción o eliminación de la matriz (MiPCT-ME) es posible, se recomienda agregar un modificador orgánico adecuado al eluyente para garantizar que los solventes orgánicos puedan eliminarse correctamente de la columna cromatográfica.
Preparación de muestras inline de Metrohm (MISP)
- Cuando se utiliza IC-MS, también se recomienda agregar un modificador orgánico al eluyente para mejorar el proceso de electropulverización.
Tenga en cuenta que la adición de modificadores orgánicos también afectará las selectividades de separación. Para los aniones estándar, el efecto es similar al observado con temperaturas más altas: se mejoran las formas de pico de los iones polarizables como nitrito, bromuro y nitrato.
Los ácidos orgánicos, por otro lado, pueden reaccionar de manera muy diferente en comparación con los aniones estándar, y su reacción también depende en gran medida del tipo de modificador orgánico utilizado. Los cromatogramas de muestra que muestran el efecto del modificador orgánico en la retención de analitos se muestran en el manual para Metrosep A Supl 10 columna.
Descargar el Manual de columna Metrosep A Supp 10 a continuación para ver ejemplos de cromatogramas que muestran los efectos del modificador orgánico en el tiempo de retención del analito.
Referencia
[1] Haddad, P. R.; jackson, p. MI. Cromatografía iónica: principios y aplicaciones; Diario de la biblioteca de cromatografía; Elsevier; Distribuidores para Estados Unidos y Canadá, Elsevier Science Pub. Co: Ámsterdam, Países Bajos; Nueva York: Nueva York, NY, EE. UU., 1990.
