Sắc ký ion (IC) là một kỹ thuật phân tích để phân tách và định lượng các ion và hợp chất phân cực. IIC đã được ngành công nghiệp dược phẩm và các cơ quan quản lý chấp nhận rộng rãi cho nhiều ứng dụng khác nhau như phân tích chất lượng nước và hóa học. Trong những năm gần đây, IC đã được công nhận để phân tích các sản phẩm dược phẩm. Dược điển Hoa Kỳ- Danh mục Thuốc Quốc gia (USP-NF, US Pharmacopeia (USP)), cơ quan tiêu chuẩn hóa chính cho các sản phẩm (sinh) dược phẩm, đã tăng cường tiềm năng của IC trong các cách tiếp cận hiện đại hóa, thiết lập nó như một kỹ thuật phù hợp và hợp lệ trong các chuyên luận chung, định lượng và kiểm tra tạp chất.

Bài viết này giới thiệu ngắn gọn các nguyên tắc của sắc ký ion, sau đó thảo luận về các ứng dụng và lợi ích của việc sử dụng IC cho phân tích dược phẩm dựa trên Chuyên luận chung USP <1065> Sắc ký ion.

Nhấp để đi thẳng đến một chủ đề:

1. Sắc ký ion là gì? 
2. Lợi ích sử dụng sắc ký ion trong ngành dược
3. Đầu dò IC và các ứng dụng của chúng theo USP <1065>

1. Sắc ký ion là gì?

Sắc ký ion là một loại sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được sử dụng để phân tách và định lượng đồng thời các ion và hợp chất phân cực, thường sử dụng cơ chế trao đổi ion làm cơ chế phân tách [1–3] (Hình động 1).

Sự kết hợp giữa các cột sắc ký trao đổi ion và đầu dò độ dẫn đại diện cho phần lớn các ứng dụng của IC, nhưng việc sử dụng các đầu dò khác như UV-Vis, điện hóa hoặc kết nối với khối phổ cũng rất phổ biến [3,4]. Các thành phần chính của một thiết lập sắc ký lỏng được hiển thị trong Hình 1. Hệ thống bao gồm một bơm cao áp có khoang chứa pha động (dung dịch rửa giải), thiết bị tiêm mẫu, cột tách (cột phân tích) và đầu dò (bao gồm các giai đoạn tiền xử lý, thu nhận và xử lý dữ liệu).

Tìm hiểu thêm về sự phát triển của sắc ký ion tại Metrohm và các kỹ thuật phát hiện đa dạng thông qua các tài liệu liên quan này.

Blog post: History of Metrohm IC – Part 1

Monograph: Ion Chromatography

Monograph: Practical Ion Chromatography – An Introduction

2. Lợi ích sử dụng sắc ký ion trong ngành dược

Mặc dù các phương pháp HPLC chiếm ưu thế trong các phương pháp sắc ký lỏng trong ngành dược phẩm, IC cũng đã được chấp nhận rộng rãi. Những lợi ích của IC so với các phương pháp sắc ký lỏng khác hoặc các phương pháp truyền thống như chuẩn độ cho ngành công nghiệp dược phẩm có thể được tóm tắt như sau [5,6]:

• phân tích nhiều chất phân tích trong một lần chạy
• chuyên dụng cho các chất phân tích ion và phân cực
• đường dẫn dòng chảy không chứa kim loại
• pha động dựa trên muối, axit yếu hoặc bazơ yếu
• áp dụng phương pháp khử nhiễu nền (Hình động 2) để có đường nền thấp và tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu thấp, cải thiện độ nhạy phân tích
• thiết bị linh hoạt: nhiều loại đầu dò khác nhau (ví dụ, độ dẫn, UV-Vis, đầu dò điện hóa hoặc kết nối với khối phổ), mức độ tự động hóa cao cho hiệu quả tối đa và chi phí sở hữu thấp (ví dụ, các tùy chọn chuẩn bị mẫu trực tuyến hoặc hiệu chuẩn với một tiêu chuẩn duy nhất) 

2.1. IC như một phương pháp được xác nhận cho các tiêu chuẩn USP-NF

Là một trong những cơ quan hàng đầu trong việc tiêu chuẩn hóa các phương pháp dược phẩm, USP-NF đảm bảo chất lượng, độ an toàn và hiệu quả của dược phẩm trong quá trình sản xuất và sử dụng [6,7]. Lịch sử của các tiêu chuẩn USP-NF rất lâu đời—trên 200 năm [6]. Tuy nhiên, các tiêu chí chất lượng mới và công nghệ đã hỗ trợ một sáng kiến hiện đại hóa toàn cầu của FDA (Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ) và USP-NF vào năm 2010.

IC như một phương pháp phân tích các tạp chất vi lượng, tá dược, thành phần dược chất (API), sản phẩm chuyển hóa và phân hủy, và các thành phần ion trong dung dịch dược phẩm và dịch cơ thể [5,8–15], đã trở thành một phương pháp được xác nhận trong nhiều chương của USP, định lượng, xác định tạp chất. Tại đây, IC đã thay thế một phần các phương pháp truyền thống hoặc được bao gồm trong các tiêu chuẩn mới tập trung vào việc sử dụng các phương pháp hiện đại nhất.

Các nguyên lý cơ bản của các kỹ thuật sắc ký được trình bày trong các Chuyên luận chung USP <621> và <1065> [16,17]. Các Chuyên luận chung này mô tả chi tiết về phương pháp luận và thiết lập tổng thể, cũng như các thông số và yêu cầu chính để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của các phương pháp sắc ký trong phân tích dược phẩm.

2.2. Các Chuyên luận chung USP <621> và <1065>: Các nguyên lý và nền tảng chính cho sắc ký

Chuyên luận chung USP <621> cung cấp góc nhìn tổng quan về một số kỹ thuật sắc ký cùng với các định nghĩa về thiết bị và quy trình (ví dụ: pha động, cột, các loại rửa giải, quy trình phương pháp), các thông số chung và các yêu cầu cho thử nghiệm tính phù hợp của hệ thống (ví dụ: độ lặp lại của hệ thống, độ nhạy của hệ thống và hiệu suất peak) [16]. Phân loại cột sắc ký cũng được giải thích với danh sách các loại vật liệu nhồi (số L), pha (G) và giá đỡ (S), làm tài liệu tham khảo cho người phân tích sắc ký [18].

Giá trị L cho các phương pháp sắc ký ion của USP và thông tin chi tiết về quy trình tương đương cột được giải thích trong bài viết dưới đây.

Blog post: Applying USP validated methods for separation column equivalency

Mặt khác, Chuyên luận chung USP <1065> cung cấp cái nhìn tổng quan toàn diện về IC [16,17] và tầm quan trọng của nó như một quy trình kiểm tra được công nhận để xác định và định lượng các chất phân tích cụ thể (các phép thử và tạp chất). Sắc ký ion là một quy trình đặc trưng hợp lệ trong nhiều trường hợp và phù hợp với tất cả các khía cạnh của sản xuất dược phẩm [8,17]. Phạm vi ứng dụng của nó rất rộng, bao gồm kiểm soát chất lượng nguyên liệu thô, chất dược phẩm, hoặc sản phẩm đã được bào chế, cũng như đánh giá nước dùng trong quy trình sản xuất, môi trường nuôi cấy, dung dịch rửa hoặc dòng nước thải [17]. USP <1065> bao gồm kiến thức cơ bản về kỹ thuật này: sắc ký ion là gì, chi tiết thiết bị (Hình 1), các cơ chế phát hiện phổ biến, quy trình và các ghi chú quan trọng để phát triển phương pháp phù hợp.

Các giải thích sâu rộng hơn về tiêu chí và yêu cầu cho việc xác nhận phương pháp được liên kết với Chuyên luận chung <1225> Thẩm định các Quy trình Phân tích. Điều này bao gồm kiểm tra tính phù hợp của hệ thống để đảm bảo rằng hệ thống IC hoạt động đúng trước khi phân tích bằng cách đánh giá các thông số bao gồm độ phân giải, thời gian lưu và hình dạng peak sắc ký, cũng như các yêu cầu đối với xác nhận với các thông số chính như độ tuyến tính, độ chính xác, độ nhạy, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) [19]. Nhìn chung, khi phát triển một phương pháp IC, việc chọn pha động và pha tĩnh thích hợp (Hình 1) là rất quan trọng để đảm bảo tách hiệu quả và chọn lọc và độ nhạy thích hợp (các yêu cầu theo USP <1225>) [17,19]. Các pha động thường bao gồm axit, bazơ hoặc muối được pha loãng trong nước tinh khiết cao, trong khi các pha tĩnh có thể là vật liệu nền silica hoặc polymer.

Do tầm quan trọng của chúng, các cột và pha động thích hợp được tích hợp trong các chuyên luận và các Chuyên luận chung của USP. Tuy nhiên, sự tương đương của cột cho phép người dùng có một số tự do trong việc triển khai phương pháp trong quy trình phân tích.

Tìm hiểu thêm về các cột IC trong chuỗi bài đăng blog của chúng tôi, bắt đầu từ đây.

Blog post: Best practice for separation columns in ion chromatography (IC) – Part 1

3. Đầu dò IC và các ứng dụng của chúng theo USP <1065>

Bốn đầu dò IC thường dùng được thảo luận trong phần này (nhấn vào để chuyển đến từng chủ đề):

• đầu dò độ dẫn
• đầu dò UV/VIS
• đầu dò điện hóa
• IC kết hợp với khối phổ

3.1. Đầu dò độ dẫn

Đầu dò IC phổ biến nhất là độ dẫn [17]. Nguyên lý – dựa trên đo độ dẫn – được trình bày trong Animation 3 [2]. Đầu dò độ dẫn đo lường khả năng dẫn điện của các ion trong dung dịch giữa hai điện cực, cung cấp thông tin về nồng độ ion hiện diện. Khi kết hợp với bộ khử nhiễu, tín hiệu nền được giảm bớt, và độ nhạy cùng tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu được nâng cao đáng kể (Animation 2) [2,17].

IC với đầu dò độ dẫn có phạm vi ứng dụng rộng rãi trong phân tích dược phẩm, bao gồm:

Đặc điểm của IC là khả năng xác định nhiều chất phân tích trong một lần chạy, ví dụ như đối với nhiều anion (acetate, chloride, citrate và sulfate trong dung dịch truyền; AN-N-051) hoặc các thành phần cation (Na, K, Ca, Mg trong dịch truyền; AN-C-022). Nhờ vào các cột IC công suất cao, việc tách chất phân tích có thể thực hiện ngay cả trong các mẫu có nền phức tạp [7].

3.2. Đầu dò UV/VIS

UV-Vis – một đầu dò quang học có thể sử dụng trực tiếp, gián tiếp hoặc với sự tạo dẫn xuất sau cột – hữu ích trong việc phát hiện các ion hấp thụ ánh sáng UV-Vis [2,17].

Đầu dò UV-Vis trực tiếp được sử dụng kết hợp với đầu dò độ dẫn, ví dụ, để xác định các ion có khả năng hấp thụ mạnh trong dải UV (nitrite, nitrate, anion hữu cơ) nhằm cải thiện khả năng phát hiện của chúng trong sự hiện diện của nồng độ cao các ion vô cơ (chloride, phosphate, sulfate) mà không hoặc chỉ hấp thụ UV rất ít [2]. Nguyên lý của đầu dò này được trình bày trong Animation 4.

Đối với đầu dò UV gián tiếp, các dung môi có độ hấp thụ cao trong vùng quang phổ nhìn thấy hoặc cực tím được sử dụng (ví dụ, dung dịch đệm phthalate) [17]. Bước sóng phát hiện được chọn sao cho dung môi hấp thụ, nhưng các ion mẫu không hấp thụ. Lựa chọn này tạo ra các peak âm tỉ lệ thuận với nồng độ analyte.

3.3. Đầu dò điện hóa

Đầu dò điện hóa là phương pháp phân tích điện hóa, trong đó dòng điện được tạo ra bởi sự oxy hóa hoặc khử của các chất phân tích tại điện cực làm việc được đo theo thời gian [20] (Animation 5).

Một yêu cầu tiên quyết là các ion mục tiêu phải có khả năng bị khử hoặc oxy hóa, tức là các chất điện hoạt [2,17]. Các chất phân tích ví dụ là các hợp chất hữu cơ, kim loại chuyển tiếp, anion (ví dụ, nitrite, nitrat, sulfide, sulfite), hoặc carbohydrate [2]. Một số ví dụ về việc sử dụng IC với đầu dò điện hóa trong ngành dược phẩm bao gồm lactose (trong sản phẩm sữa và thực phẩm bổ sung, AN-P-089), catecholamines (trong dung dịch tiêm dược phẩm, AN-P-053), gentamicin (trong dung dịch gentamicin, AN-P-080), và propylene glycol (trong dung dịch diclofenac bôi ngoài da, AN-P-076).

Tài liệu của chúng tôi White Paper mô tả việc xác định polyribosylribitol phosphate (PRP) trong vaccine Haemophilus influenzae vsử dụng IC với đầu dò điện hóa (Hình 4). 

Đường màu đen trong sắc đồ thể hiện dung dịch chuẩn có nồng độ 3 µg/mL PRP. Đường xanh lá chỉ ra tổng hàm lượng PRP (nồng độ cuối cùng 19,42 mg/L), trong phạm vi 80–120% so với nhãn công bố (16–24 mg/L). Theo tiêu chí chất lượng, PRP tự do yêu cầu phải ít hơn 20% tổng hàm lượng PRP. Mẫu (đường xanh lá trong sắc đồ) cho thấy hàm lượng PRP tự do đã xác định (nồng độ cuối cùng 2,03 mg/L) và phù hợp với yêu cầu.

3.4. IC kết hợp với khối phổ

Sắc ký ion có thể kết hợp với khối phổ để nâng cao độ nhạy phát hiện đối với các axit hữu cơ, carbohydrate, hoặc các nguyên tố vi lượng. Thiết bị trơ hóa chất đảm bảo tính linh hoạt đối với pha di động được sử dụng và bảo vệ khỏi sự nhiễm bẩn, điều này đặc biệt quan trọng đối với phân loại nguyên tố vi lượng. Kỹ thuật khử nhiễu nền trong IC đảm bảo rằng dung dịch vào các khối phổ cực kỳ nhạy này chỉ chứa các chất phân tích và nước (và có thể một số chất hữu cơ). Điều này có lợi cho điều kiện vận hành ổn định, độ nhạy phân tích và kéo dài tuổi thọ của thiết bị.
 

Tìm hiểu thêm về sự kết hợp IC với MS qua các tài nguyên của chúng tôi tại đây.

Hyphenation of ion chromatography and mass spectrometry

White Paper: An introduction to ion chromatography mass spectrometry (IC-MS)

Kết luận

Sắc ký ion là một công cụ phân tích mạnh mẽ và đa năng cho các ứng dụng dược phẩm. Nó có khả năng xử lý nhiều loại mẫu khác nhau và cung cấp độ nhạy cao khi phát hiện các chất ion và có thể ion hóa. Khả năng kết hợp các chiến lược phát hiện khác nhau của IC làm cho nó trở thành công cụ không thể thiếu trong sản xuất dược phẩm và kiểm soát chất lượng.

Your knowledge take-aways

Drug monographs, assays, and impurity evaluations – Bring your USP methods up to date with Metrohm Ion Chromatography

Flyer: Bring your USP methods up to date!

Blog post: Applying USP validated methods for separation column equivalency

White Paper: When HPLC fails: IC in food, water, and pharmaceutical analysis

On-demand webinar: From APIs to impurities and excipients – Ion chromatography for pharmaceutical analysis

On-demand webinar: Ion chromatography for pharmaceutical applications

On-demand webinar: Analysis of impurities in pharmaceuticals using ion chromatography