Los ácidos grasos utilizados en la producción deben verificarse durante los procesos de producción. Las similitudes en los ácidos grasos pueden dificultar la identificación del ácido graso exacto a través del algoritmo de correlación de Pearson utilizado para la identificación; sin embargo, la verificación con un algoritmo de valor p produce un método más confiable para garantizar que se utilice el material correcto en la fabricación. El Metrohm Instant Raman Analyzer 3 (Mira M-3) es un espectrómetro Raman portátil diseñado para una identificación y verificación rápida y no destructiva de muestras. El proceso de identificación de muestras implica medir un espectro de la muestra y compararlo con los espectros existentes en una biblioteca. Luego, el resultado se muestra con una correlación de Pearson. La verificación de muestras se realiza con un conjunto de entrenamiento de los espectros que contiene la variabilidad aceptada entre diferentes muestras del mismo material. El conjunto de entrenamiento se analiza con el análisis de componentes principales (PCA) y se informa como un porcentaje de probabilidad de que la muestra medida se encuentre dentro de un nivel de confianza establecido por el operador. Por lo general, se utiliza un nivel de confianza del 95 % para la verificación de materiales. Si bien tanto la identificación de una biblioteca como la verificación con un conjunto de entrenamiento son útiles, la verificación puede detectar diferencias muy pequeñas en las muestras. Los ácidos grasos y el alcohol graso discutidos en esta nota de aplicación serán el ácido láurico (C₁₁H₂₃CO₂H), ácido mirístico (C₁₃H₂₇CO₂H), ácido palmítico (C₁₅H₃₁CO₂H), ácido esteárico (C₁₇H₃₅CO₂H) y alcohol estearílico (C₁₇H₃₇OH). Figura 1 muestra los espectros de estos materiales y las similitudes espectrales, lo que ilustra la dificultad de la diferenciación solo en la correlación.

Creación de un procedimiento operativo (OP)

En el software MiraCal, cree un OP para construir la biblioteca, seleccione la pestaña Procedimientos operativos y cree un nuevo OP "Ácidos grasos". Los parámetros se establecen en potencia de láser 5, promedio de 1 y tiempo de integración automática. Adquiera un espectro de cada muestra con el OP, nombre cuidadosamente cada muestra y sincronice los datos con la base de datos del software MiraCal.

Creación y prueba de la biblioteca de ácidos grasos

A partir de las muestras que se guardaron con el OP "Ácido graso", se puede crear la biblioteca de ácidos grasos. Seleccione la pestaña Bibliotecas y nombre la nueva biblioteca "Biblioteca de ácidos grasos". Agregue las muestras recolectadas previamente a la "Biblioteca de ácidos grasos" y guárdela. A continuación, cree un nuevo OP con el nombre "Prueba de biblioteca" y configure los parámetros en potencia de láser 5, promedio de 1 y tiempo de integración automática. Con la pestaña Evaluaciones seleccionada, marque la casilla de identificación y seleccione la “Biblioteca de ácidos grasos”. Guarde el OP "Prueba de biblioteca" y sincronícelo con su sistema. El sistema ahora se puede usar para comparar muestras con la "Biblioteca de ácidos grasos". Un ejemplo de puntajes de coincidencia para cada muestra de ácido graso se ilustra en tabla 1.

Creación y prueba del conjunto de entrenamiento de ácidos grasos con valor p

Seleccione el OP "Ácidos grasos" que se creó en el experimento anterior y proceda a recopilar ~ 20 espectros de cada muestra de ácido graso. Una vez terminado, conecte el instrumento al software MiraCal y sincronice los datos con la base de datos. El siguiente paso es crear un conjunto de entrenamiento para cada muestra. Seleccione la pestaña Conjuntos de entrenamiento en el software y proceda a crear nuevos conjuntos de entrenamiento para cada material ingresando el nombre de la muestra como el nombre del conjunto de entrenamiento y agregando los ~20 espectros que se recolectaron en el paso anterior. Una vez que se hayan creado y guardado los 5 conjuntos de entrenamiento, el siguiente paso es crear nuevos OP que correspondan a cada conjunto de entrenamiento. Los cinco OP tendrán los mismos parámetros de adquisición: tiempo de integración automática seleccionado, potencia del láser 5 y promedio establecido en 1. En la pestaña Evaluación del OP, marque la casilla Verificación para cada OP y agregue el conjunto de entrenamiento correspondiente presionando el botón Botón “Conjunto de entrenamiento”.

Una vez que esto haya terminado, guarde cada OP y sincronice la base de datos del software para agregar los OP al sistema. Ahora mida un espectro de cada muestra contra cada OP. Los resultados de Pasa/Falla se registran en Tabla 2.

Como vimos anteriormente, la comparación simple de bibliotecas (correlación de Pearson) no siempre identifica con precisión el material correcto cuando hay otros materiales similares en la biblioteca. Los puntajes de coincidencia de materiales similares solo pueden diferir en 0.01–0.03 Índice de calidad de aciertos (HQI), que es difícil de interpretar y reduce la confianza del análisis (tabla 1).

La verificación mide la muestra contra el conjunto de entrenamiento seleccionado, y si la muestra cae dentro de ese conjunto de entrenamiento, hay un resultado positivo ("Pasa"). Si la muestra cae fuera del conjunto de entrenamiento, hay un resultado negativo ("Fallo"). Al crear modelos de verificación para cada una de las muestras de ácidos grasos y probar cada modelo con cada muestra, podemos ver que el instrumento siempre puede aceptar, o "Pasa", la muestra correcta y rechazar, o "Falla", muestras que son similares pero diferentes. Además, el resultado de la verificación es fácil de interpretar (Tabla 2). Por ejemplo, el ácido palmítico pasa con un 33,1 % de confianza que está dentro del intervalo de confianza del 95 % establecido.