Il monitoraggio spettroelettrochimico della resazurina è stato eseguito con SPELEC, uno strumento completamente integrato per la spettroelettrochimica che combina sia la componente elettrochimica (bipotenziostato/galvanostato) che quella spettroscopica (sorgente luminosa UV-Vis e rivelatore) in un sistema portatile. Sebbene SPELEC contenga una sorgente luminosa con un intervallo di lunghezze d'onda compreso tra 200 nm e 900 nm, è stato utilizzato un LED a 395 nm (LEDVIS395) come sorgente luminosa di eccitazione. Questo LED ha un intervallo di emissione luminosa ben definito, evitando qualsiasi contributo di luce nelle lunghezze d'onda in cui Alamar Blue è fluorescente.

Il resto della configurazione era costituito da una sonda di riflessione (RPROBE-VIS-UV), una cella di riflessione spettroelettrochimica per elettrodi serigrafati per celle a flusso a strato sottile (TLFCL-REFLECELL) e i componenti inclusi nel kit di fluorescenza (FLKIT). Il FLKIT contiene due fibre ottiche corte (600 μm), due filtri ottici (uno dei quali filtra lunghezze d'onda comprese tra 230 e 500 nm, e l'altro lunghezze d'onda comprese tra 300 e 750 nm) e due supporti per i filtri. La configurazione completa è mostrata in Figura 1.

L'elettrodo circolare in carbonio serigrafato integrato a cella di flusso a strato sottile (TLFCL110-CIR) è costituito da una piastra ceramica piatta contenente la cella elettrochimica con sistema a tre elettrodi (elettrodo di lavoro circolare in carbonio di 4 mm di diametro, un controelettrodo in carbonio e un elettrodo di pseudo-riferimento in argento, Figura 2). Questa piattaforma elettrodica è coperta da una slitta con un canale che limita lo spessore della soluzione a 400 μm.

SPELEC è stato controllato con DropView SPELEC, un software dedicato che fornisce informazioni spettroelettrochimiche e include strumenti per eseguire un'adeguata elaborazione e analisi dei dati raccolti. Tutto l'hardware e il software utilizzati per questo studio sono elencati nella Tabella 1.

In order to reduce the resorufin (generated in the previous step) to dihydroresorufin, the next potential pulse was performed by applying -1.00 V for 300 s. Figure 5a displays the electrochemical signal (grey line) as well as the evolution of the fluorescence band at 590 nm with time (green line). Figure 5b shows the fluorescence spectra recorded during this second step.

Sebbene l'intensità della banda di emissione a 590 nm fosse completamente stabile alla fine del primo passaggio (Figura 4a, linea verde), il secondo passaggio dimostra che questa banda di emissione diminuisce bruscamente per 100 s quando viene applicato un potenziale di -1,00 V. Non è stata rilevata alcuna fluorescenza durante il resto dell'esperimento, dimostrando la riuscita riduzione della resorufina (altamente fluorescente) a diidroresorufina, una molecola non fluorescente. (Figura 3).

Infine, è stato applicato un terzo passaggio di potenziale con l'obiettivo di riossidare la diidroresorufina generata nel secondo passaggio, riportandola a resorufina. La Figura 6a mostra il segnale elettrochimico (linea grigia) e l'evoluzione spettrale della banda di fluorescenza centrata a 590 nm (linea verde) quando è stata applicata una tensione di -0,10 V per 300 s. Questo grafico mostra che il segnale ottico raggiunge i valori di fluorescenza ottenuti nel primo impulso dell'esperimento di cronoamperometria, mostrato in Figura 4a.

L'evoluzione degli spettri mostrata in Figura 6b conferma l'aumento della banda di fluorescenza centrata a 590 nm. La diidroresorufina viene completamente ossidata nuovamente a resorufina poiché il massimo di fluorescenza osservato nel primo passaggio dell'esperimento (Figura 4b) si ottiene anche qui nel terzo passaggio. Pertanto, la reversibilità del processo redox tra resorufina e diidroresorufina è chiaramente dimostrata.