Il tris(idrossimetil)amminometano (noto anche come TRIS, THAM o trometamina) è un componente comune delle soluzioni tampone nelle scienze biologiche. Ha un'elevata capacità tampone tra pH 7,2 e 9,0, un pKa di 8,2 (20 °C) e si complessa con ioni metallici, rendendo il TRIS ideale per applicazioni in biochimica e biologia molecolare [1]. I tamponi TRIS vengono utilizzati per la purificazione del DNA, la separazione di proteine mediante SDS-PAGE (elettroforesi su gel di poliacrilammide con sodio dodecil solfato) o la separazione di acidi nucleici mediante elettroforesi su gel [2]. Il TRIS viene anche utilizzato per trattare l'acidosi metabolica e può penetrare la membrana cellulare nella sua forma non ossidata, fungendo quindi da tampone intracellulare [3]. Per questi motivi, è essenziale controllare la purezza del TRIS, soprattutto per l'uso nell'industria farmaceutica.
Un robusto metodo di cromatografia ionica isocratica (IC) con colonna Metrosep C Supp 2 - 250/4.0 e eluente acido metansolfonico (MSA) è ideale per determinare il TRIS e qualsiasi impurità cationica. Il sistema IC microbore (MB) è dotato del rivelatore di conduttività IC MB, sensibile e stabile agli eluenti MSA. Ciò garantisce bassi volumi di vuoto, stabilità a lungo termine del sistema analitico e risultati precisi per la quantificazione del TRIS.
I campioni sono stati preparati a partire da polvere di base Trizma® (TRIS) di qualità p.a. (CAS 77-86-1, acquistata da Sigma Aldrich n. 93350). Per la valutazione del metodo, due diverse concentrazioni di TRIS (10,37 mg/L e 103,7 mg/L) sono state sciolte in un eluente (acido metansolfonico allo 0,1%).
Il cromatografo ionico microbore 930 Compact IC Flex Oven/DEG/MB era dotato del MSA-stable IC Conductivity Detector MB (Figura 1). Per questa configurazione non soppressa è stato utilizzato un eluente costituito da MSA allo 0,1% (v/v) (15 mmol/L di MSA) (Tabella 1). S I campioni sono stati iniettati utilizzando la tecnica di iniezione parziale intelligente Metrohm (MiPT, Figura 2). Questa tecnica riempie il loop di campionamento da 250 μL con un volume misurato con precisione e liberamente selezionabile (da 5 a 40 μL in questo studio applicativo). Durante questo processo, un Dosino con un'unità di dosaggio da 2 mL esegue gli incrementi di dosaggio precisi. La MiPT consente la calibrazione da un singolo standard, che è stata eseguita in questo caso in un intervallo di 5-140 mg/L di TRIS.
La selezione del volume variabile può essere applicata anche all'iniezione del campione. In tali situazioni, si seleziona un volume di iniezione ridotto, ad esempio per un campione altamente concentrato, omettendo così la fase di diluizione manuale.
Tipici cationi inorganici (ad esempio litio, sodio, potassio, magnesio e calcio) sono stati iniettati nella colonna Metrosep C Supp 2 per verificare potenziali problemi di co-eluizione.
| Colonna | Metrosep C Supp 2 - 250/4.0 |
|---|---|
| Eluente/diluente | c(MSA) = 0.1 % (v/v) |
| Flow rate | 1.0 mL/min |
| Temperature | 30 °C |
| Injection volume | 5–40 µL (MiPT) |
| Detection | Direct conductivity |
La determinazione TRIS viene eseguita in meno di 8 minuti utilizzando l'eluizione isocratica sul sistema MB IC. Il metodo si è dimostrato privo di interferenze per quanto riguarda i cationi principali, come descritto sopra.
Il sodio ha avuto un tempo di ritenzione di 4,1 minuti. Modificando i parametri del metodo, ad esempio riducendo la temperatura della colonna a 20 °C, si aumenta la risoluzione tra sodio e TRIS. Con i parametri del metodo utilizzati (Tabella 1), è possibile ottenere una determinazione precisa utilizzando l'altezza del picco per la valutazione. I tassi di recupero per 100 mg/L di TRIS sono stati del 99-103% con una deviazione standard relativa <3%, a dimostrazione dell'accuratezza di questo metodo.
Le materie prime utilizzate nell'industria farmaceutica, come soluzioni e tamponi, devono soddisfare i più elevati standard qualitativi per quanto riguarda la loro esatta concentrazione e purezza.
La configurazione di questo studio applicativo comprende un sistema IC microbore, un rivelatore di conducibilità stabile all'MSA e un MiPT per la calibrazione automatica con un singolo standard e una scelta flessibile dei volumi di iniezione del campione. Il metodo è adatto per la quantificazione di TRIS nell'intervallo 5-200 mg/L. Garantisce una determinazione affidabile del componente tampone comune TRIS in modo semplice e preciso.
- Deutscher, M. P. Guide to Protein Purification; Gulf Professional Publishing, 1990.
- Westermeier, R. Electrophoresis in Practice: A Guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations; John Wiley & Sons, 2016.
- Sirieix, D.; Delayance, S.; Paris, M.; et al. Tris-Hydroxymethyl Aminomethane and Sodium Bicarbonate to Buffer Metabolic Acidosis in an Isolated Heart Model. Am J Respir Crit Care Med 1997, 155 (3), 957–963. https://doi.org/10.1164/ajrccm.155.3.9117032.
Condividi l'applicazione
Download PDF